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嗜水气单胞菌毒力特性研究

付乔芳

  嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是我国淡水养殖中常见的致病菌之一,常引起水生动物大面积爆发败血症。通常认为这类细菌只有中等毒力,属于条件性致病菌。致病菌的研究利用多以培养物方式保藏;培养物保藏过程不仅要求达到高存活率、无污染,还必须保持其特性的稳定性,如形态特征、培养特征、生理生化特性、遗传特性以及细胞化学组成等;因此,细菌菌种的保藏具有非常重要的意义。但是目前情况下,人们很难控制细菌所有特性在传代过程中不衰退或不发生变异。引起细菌特性的改变如毒力减弱,很大程度上,是与传代过多或保藏方法不适等因素引致。虽然不能保证细菌在传代过程中和保藏过程中完全不衰退或不变异,但我们可以通过改变某些因素使这种衰退或变异降到最低限度,使该菌种的主要特性在适宜的条件下保持相应的稳定。本论文通过对嗜水气单胞菌的5种毒力基因进行扩增,探讨毒力基因分布与毒力的相关性;同时,对传代和保藏前后的菌株分别进行毒力基因的扩增和毒力的测定,研究嗜水气单胞菌在保藏过程中毒力减弱与毒力基因分布之间的关系。并针对保藏过程中易导致毒力减弱的温度和培养基两个因素,其对毒力基因分布稳定性的影响来对保藏过程中毒力减弱的机制进行初探。 试验选取经鉴定为嗜水气单胞菌的21株菌株作为试验对象,对嗜水气单胞菌的5种主要毒力因子气溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、丝氨酸蛋白酶(ahpA)、抗金属蛋白酶(ast)、肠毒素(altA)设计5对特异性引物,用PCR方法进行检测,采用急性毒性试验方法测定菌株对异育银鲫(Carassais auratus gibebio)的半数致死量(50% lethal dose,LD_(50)),细菌药物敏感试验纸片扩散(K-B)法检测对抗生素的敏感性,结果显示:除菌株Hong12的LD50约为10~9 cfu,毒力弱外,其它菌株的毒力均较强, LD_(50)均在10~6 cfu左右。aerA、ahpA、hlyA、altA、ast五种毒力基因的携带率分别为77.8%、88.9%、100%、100%、88.9%。通过比较嗜水气单胞菌毒力基因的分布情况与其对异育银鲫致病性试验结果可以发现,aerA、ahpA为嗜水气单胞菌致病的主要毒力因子,与致病性存在相关性,ast与致病力也存在一定相关性,但不是主要毒力因子,hlyA、altA与致病性不存在相关性。21株嗜水气单胞菌对青霉素、羧苄青霉素、万古霉素不敏感,对复合磺胺、头孢噻肟、利福平中毒敏感,对呋喃妥因、氯霉素、四环素、氧氟沙星高度敏感。 为了了解试验菌株毒力基因在传代过程中的稳定性,对传代前后试验菌株的毒力和毒力基因进行测定和检测。采用急性毒性实验方法测定10株嗜水气单胞菌原代、第10代及第20代的菌株对异育银鲫的半数致死量,通过聚合酶链式反应(PCR)检测原代、第10代及第20代的菌株中五种毒力基因aerA、hlyA、ahpA、altA、ast的变化情况。试验结果表明,嗜水气单胞菌在传代过程中毒力基因分布相对较稳定,但是ahpA基因极易发生变异,在培养基上连续多次传代后,毒力逐渐减弱乃至失去毒力。可推知,ahpA基因与毒力相关性最大,并易受传代影响。 为了了解嗜水气单胞菌毒力基因在保藏过程中的稳定性,对保藏期间(3天、1周、2周、4周、8周、16周及32周)4株嗜水气单胞菌的毒力和毒力基因进行测定和检测。采用急性毒性实验方法分别测定5株嗜水气单胞菌在各个保藏期的菌株对异育银鲫的半数致死量,通过聚合酶链式反应(PCR)检测各个保藏期的菌株中五种毒力基因aerA、hlyA、ahpA、altA、ast的变化情况。试验结果表明,不同保藏期单个毒力基因的变化经分析可知各具特点,并不具有一致的变化规律;但是具有一定的变化特点,即保藏一段时间后,菌株的毒力基因都会不同程度转为阴性,这与毒力逐渐下降的趋势相一致,毒力基因aerA、ahpA、ast的存在与毒力存在一定的相关性。 同时,对保藏过程中易导致毒力发生变化的温度和培养基两个因素进行试验,探究其对毒力基因分布稳定性的影响,选用温度三水平(常温、4℃、-20℃)、培养基三种(脑心浸脂培养基、LB培养基、肉汤培养基)作为保藏的因素,保藏一个月之后,采用聚合酶链式反应(PCR)检测各个保藏因素条件下的菌株五种毒力基因的分布情况。试验结果表明,4℃保藏条件下,基因型稳定型最高,室温(25℃)条件下,aerA基因易丢失,影响毒力大小;在-20℃条件下,与毒力强弱关系不大的altA、hlyA易丢失,不影响毒力大小,而脑心浸脂培养基不适合作为嗜水气单胞菌的培养基。 总之,本论文通过对21株嗜水气单胞菌毒力特性的研究,给致病菌相关特性的深入研究提供了进一步的理论数据。……   
[关键词]:嗜水气单胞菌;保藏;毒力;毒力因子;毒力基因;传代;稳定性;影响因素
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:上海海洋大学2011年