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红松种壳组成及多酚提取分离与抗氧化抗肿瘤功能研究

苏晓雨

  红松(Pinus koraiensis)广泛分布于在我国东北地区,红松种壳中富含多种活性成分,其中多酚类成分是重要的抗氧化剂,具有很大的开发潜力。本文系统地研究了红松种壳中有效成分的组成及其中多酚成分的抗氧化活性及抗肿瘤作用途径,为综合开发及利用红松种壳资源用于防治氧化损伤提供了理论基础。 采用水蒸气蒸馏法提取并通过气相色谱-质谱联用法分析松壳中的挥发性成分及多酚组成;利用分光光度法分析红松种壳中活性成分的组成;采用超声波辅助法提取松壳多酚,以单因素试验为基础结合响应面实验优化松壳多酚的提取工艺;选取大孔树脂法纯化松壳多酚并通过静态及动态吸附试验优化了工艺条件;通过建立体外模型研究了松壳多酚抑制生理性及非生理性自由基的作用,以及松壳多酚对铁离子的鳌合作用和总还原能力;通过建立细胞、组织等体外模型研究松壳多酚抗氧化溶血的作用及抗脂质过氧化的能力,深入研究了松壳多酚的抗氧化活性;建立动物亚急性衰老模型及γ射线辐射模型,通过研究动物的生理指标及氧化相关酶的活性深入探讨松壳多酚抗氧化功能及其作用机制;通过MTT比色法、集落形成试验法及琼脂糖凝胶电泳法分别研究了松壳多酚对肿瘤细胞增殖、诱导分化及凋亡的影响;采用免疫染色法研究了松壳多酚对细胞中原癌基因Bcl-2及Bax表达的影响并采用分光光度法测定了细胞中凋亡酶caspase-9活力的变化;流式细胞法研究松壳多酚对肿瘤细胞周期的影响,从而探索红松种壳多酚抗肿瘤作用的途径及机制;建立小鼠体内的S180及H22腹水瘤及实体瘤模型,用以研究松壳多酚提取物的体内抗肿瘤作用,并通过研究动物血清中关键性的代谢酶活力的变化来探索松壳多酚在机体内发挥抗肿瘤作用的途径。 通过以上各项研究得到结果如下:气相色谱-质谱联用法分析出红松种壳中的23种化学成分,其中酚类化合物为香芹酚、二叔丁基对甲基苯酚及6-叔丁基-2,4-二甲酚等;优化得到的松壳多酚的最佳提取工艺为:提取时间2.80 h、料液比1:26(g/mL)、乙醇浓度43 %、提取温度80℃;优化得到的松壳多酚最佳纯化工艺为:采用AB-8型大孔树脂进行吸附,上样浓度1.5 mg/mL,上样流速2.0 BV/h,以1.5 BV/h流速采用30 %及70 %乙醇进行梯度洗脱。对松壳多酚抗氧化活性的研究结果显示松壳多酚能够有效的抑制羟自由基及超氧阴离子等生理性自由基,EC50值分别为0.391 mg/mL及4.37mg/mL,松壳多酚还能够明显的清除DPPH及ABTS等非生理性自由基,EC50值分别为0.023 mg/mL及0.46 mg/mL。研究发现松壳多酚能够显著地抑制红细胞的氧化溶血并对肝匀浆及卵黄脂质过氧化具有非常有效的抑制作用,其中对肝匀浆脂质过氧化的抑制率为91.50 %(7.0 mg/mL),对卵黄过氧化的抑制率为95.44 %(1.5 mg/mL)。 通过对松壳多酚体内抗氧化作用的研究发现,松壳多酚能够显著地抑制小鼠的亚急性衰老反应,中剂量组及大剂量组可以明显提高小鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低丙二醛(MDA)含量,提高谷胱甘肽(GSH)的含量。松壳多酚还能够有效的抑制及修复由γ射线辐射引起的氧化损伤。并且松壳多酚能够有效的抑制HT29(人结肠癌细胞)、H460(人肺癌细胞)、SCG7901(人胃癌细胞)及MCF-7(人乳腺癌细胞)肿瘤细胞的增殖,其中松壳多酚抑制HT29细胞增殖的作用最为明显。经松壳多酚作用后HT29细胞集落形成数明显降低并且细胞的DNA发生裂解弥散现象,这说明松壳多酚具有诱导肿瘤细胞分化及凋亡的作用。 本研究发现松壳多酚的作用影响了肿瘤细胞中癌基因的表达及细胞周期的进程,研究发现松壳多酚具有下调HT29细胞中Bcl-2基因表达及上调Bax基因表达的作用,并且这种作用具有时间及剂量依赖性;同时松壳多酚的作用使HT29细胞中处于G1期的细胞百分率上升,说明松壳多酚对细胞G1期具有上调作用,而S期细胞百分率下降,说明松壳多酚对细胞S期具有下调作用,结果显示松壳多酚的作用使细胞发生G1/S期阻滞从而延缓了细胞从G1期到S期的进程,并且这种细胞周期阻滞作用呈现剂量依赖性;体内抗肿瘤研究发现松壳多酚对S180及H22实体瘤细胞具有抑制作用,松壳多酚低中高各剂量组对小鼠S180实体瘤的抑制作用均显著,抑制率分别为25.00 %、31.82 %及34.09 %,中高剂量组对H22实体瘤抑制作用显著,抑制率分别为26.32 %及27.36 %;研究发现经松壳多酚作用后,荷瘤动物血清内乳酸脱氢酶及醛缩酶的活力下降,说明松壳多酚在体内发挥的抗肿瘤作用与其能够抑制肿瘤细胞的糖代谢过程有关。……   
[关键词]:红松;种壳;多酚;抗氧化;抗肿瘤
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:哈尔滨工业大学2011年