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黄芪水提取液对横纹肌收缩力的影响及其机制研究

贺永贵

  [目的]观察黄芪水提取液(radix astragali aqueous extract, RAAE)抗氧化活性和对横纹肌收缩力的影响,并探讨其可能的细胞内信号转导机制。 [方法]实验对象选用昆明小鼠、Wistar大鼠和H9c2心肌细胞株。 1.常温常压耐缺氧实验:将40只昆明小鼠,随机分成4组,每组10只,即对照组、黄芪水提取液小剂量组、黄芪水提取液中剂量组和黄芪水提取液大剂量组,分别灌胃0.9%NaCl、黄芪水提取液6g/kg、12g/kg和24g/kg,3W后进行耐缺氧时间的测定。 2.负重游泳力竭实验:将30只昆明小鼠,随机分成3组,每组10只,即对照组、模型组和黄芪水提取液组,依次分别灌胃0.9%NaCl、0.9%NaCl和黄芪水提取液12g/kg,3W后制备肢体缺血/再灌注模型,然后进行负重游泳力竭时间的测定。 3.在体骨骼肌收缩力学实验:取18只Wistar大鼠,随机分成3组,每组6只,即假手术组、模型组和黄芪水提取液组,依次分别灌胃0.9%NaCl、0.9%NaCl和黄芪水提取液6g/kg,3W后制备骨骼肌缺血/再灌注模型,然后应用电生理学方法,观察黄芪水提取液对大鼠在体—坐骨神经腓肠肌单收缩(twitch, Te)最大收缩幅度(performance of contration, Pt)和强直收缩(tetanus, Tw)最大收缩幅度(Pt)的影响。 4.抗氧化指标测定:进行在体骨骼肌收缩力学指标测定后,采集大鼠血清检测活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA),取腓肠肌和心肌组织检测SOD活性、MDA含量。 5.离体骨骼肌收缩力学实验:Wistar大鼠,分离腓肠肌制备离体灌流模型,随机分为3组,每组6例,即对照组、模型组和黄芪甲苷(astragalosideⅣ)组,分别在灌流液中加入0.9%NaCl或黄芪甲苷50μM,观察黄芪甲苷对腓肠肌单收缩最大收缩幅度和强直收缩最大收缩幅度的影响。离体骨骼肌收缩力学指标测定后,取腓肠肌标本电镜下观察腓肠肌超微结构的改变。 6.离体心脏灌流心功能实验:Wistar大鼠,制备大鼠离体心脏灌流模型,随机分为对照组和黄芪组,分别在灌流液中加入0.9%NaCl或黄芪甲苷50gM,观察观察黄芪甲苷对心脏左室发展压(leftventricular-developed pressure, LVDP)和冠脉流量(coronary flow, CF)的影响。离体心脏功能测定后,取心肌标本电镜下观察心肌超微结构的改变。 7.黄芪甲苷的抗氧化活性作用细胞内信号转导途径: ①H9c2细胞氧化损伤模型:用H2O2(500μM)造成H9c2细胞线粒体氧化应激损伤,采用线粒体特异性荧光染料四甲基罗丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester, TMRE)进行染色,通过激光扫描共聚焦显微镜成像法测定H9c2细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)的变化,以判断线粒体膜通透性转移孔(mitochondrial-permeability transition pore, mPTP)的开放程度,进而确定线粒体的损伤程度。 ②黄芪甲苷对GSK-3p及Akt磷酸化的影响:给予不同浓度的黄芪甲苷处置培养的H9c2细胞10min20分钟后,用Western blot法检测黄芪甲苷对H9c2细胞GSK-3p (Ser9)、Akt磷酸化的影响及给予P13K抑制剂LY294002(LY,10μM后对GSK-3β(Ser9)磷酸化的影响。 ③黄芪甲苷对mPTP开放的影响:给予不同浓度的黄芪甲苷处置培养的H9c2细胞20min后,用激光扫描共聚焦显微镜观察对TMRE红色荧光强度的影响,即黄芪甲苷能否阻止氧化应激引起的mPTP开放;观察给予P13K抑制剂LY294002(LY, 10μM) lOmin后,再处置黄芪甲苷20min时TMRE红色荧光强度的改变。 ④黄芪甲苷抑制mPTP开放的机制:cGMP抑制剂ODQ(5μM)和PKG抑制剂KT5823(1μM)处置10min后,给予黄芪甲苷处置20min,用激光扫描共聚焦显微镜观察对TMRE红色荧光强度的影响;cGMP抑制剂ODQ(1H-[1,2,4]恶二唑[4,3-a]喹喔啉-1-酮,oxadiazole quinoxalin,5μM)和PKG抑制剂KT5823(1μM)处置l 0min后,给予黄芪甲苷处置20min,用Western blot法检测对H9c2细胞GSK-3β(Ser9)、血管扩张刺激磷蛋白(Vasodilator stimulated phosphoprotion,VASP)磷酸化的影响。 ⑤黄芪甲苷对NO生成的影响:采用DAF-FM (3-Amino,4-aminomethyl-2 , 7 -difluorescein, diacetate)进行荧光染色,用激光共聚焦显微镜观察黄芪甲苷对H9c2细胞内一氧化氮(nitric oxide, NO)生成的影响。 [结果] 1.黄芪水提取液对小鼠耐缺氧时间的影响:灌胃3W后,黄芪水提取液中、大剂量组与对照组比较,小鼠的耐缺氧时间明显增加(P<0.05);黄芪水提取液小剂量组与对照组比较,小鼠的耐缺氧时间无统计学差异(P>0.05)。 2.黄芪水提取液对小鼠骨负重游泳力竭时间的影响:在灌胃3W后,黄芪水提取液组的小鼠负重游泳时间比模型组显著延长(P<0.05),模型组比对照组显著缩短(P<0.05),有统计学意义。 3.黄芪水提取液对大鼠在体骨骼肌收缩力的影响:黄芪水提取液组的单收缩的最大收缩幅度和强直收缩的最大收缩幅度显著增强,与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。 4.黄芪水提取液对大鼠血清ROS、SOD、MDA和腓肠肌、心肌组织中SOD、MDA含量的影响:黄芪水提取液组大鼠的血清中ROS活性减弱、SOD活性增强、MDA含量降低(均P<0.05),腓肠肌和心肌组织中SOD活性显著增强、MDA含量明显降低,与模型组比较差异显著(均P<0.05)。 5.黄芪甲苷对离体骨骼肌缺氧模型腓肠肌收缩力学指标的影响:黄芪甲苷组的单收缩的最大收缩幅度(Pt)和强直收缩的最大收缩幅度(Pt)显著增强,与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。 6.黄芪甲苷对离体心脏缺血/再灌注损伤模型心功能的影响:黄芪甲苷组的冠脉流量(coronary flow, CF)、左心室发展压(left ventricular-developed pressure, LVDP)明显高于对照组(均*P<0.05)。 7.电镜下观察腓肠肌和心肌超微结构的改变:缺血缺氧损伤造成了腓肠肌组织和心肌组织的线粒体损伤,而给予黄芪甲苷处置的则线粒体损伤明显减轻。 8.黄芪甲苷的抗氧化活性作用细胞内信号转导途径: ①黄芪甲苷对GSK-3p及Akt磷酸化的影响:在给予不同浓度的黄芪甲苷处置培养的H9c2细胞10min20分钟后,发现黄芪甲苷30μM、50μM、80μM的药物浓度均能增加磷酸化的GSK-3β表达,与对照组比较差异显著(*P<0.05)。黄芪甲苷增加GSK-3β磷酸化的作用可被抑制剂LY294002所抑制,同时黄芪甲苷可明显增加Akt (Ser473)的磷酸化,说明PI3K/Akt信号通路参与黄芪甲苷对GSK-3β的作用。 ②黄芪甲苷对mPTP开放的影响:与对照组相比,50-80μM的黄芪甲苷能够显著抑制TMRE红色荧光强度的减弱(P<0.05),即黄芪甲苷能够阻止氧化应激引起的mPTP开放。这种作用被PI3K抑制剂LY294002所阻断。 ③黄芪甲苷抑制(?)nPTP开放的机制:黄芪甲苷阻止TMRE荧光强度减弱的作用,可被cGMP抑制剂ODQ和PKG抑制剂KT5823所抑制(P<0.05),提示cGMP/PKG信号通路参与了黄芪甲苷的抗氧化应激损伤的保护作用。此外,Westernblot结果显示,黄芪甲苷增加GSK-3β磷酸化的作用被ODQ和KT5823所抑制,同时黄芪甲苷能够明显增加VASP的磷酸化,进一步说明cGMP/PKG作为GSK-3p的上游信号参与黄芪甲苷的心肌保护作用。 ④黄芪甲苷对NO生成的影响:通过激光扫描共聚焦显微镜观察,与对照组相比,黄芪甲苷明显增强H9c2细胞DAF-FM的绿色荧光强度,此作用可被NOS抑制剂L-Name(200μM)和PI3K抑制剂LY294002(LY,10μM)所阻断,提示黄芪甲苷通过NOS调节NO的产生,且这种作用可能与PI3K/Akt信号通路有关。 [结论] 1.黄芪水提取液具有提高骨骼肌和心肌收缩力的作用,这种作用可能与其抗氧化活性有关; 2.黄芪的水提取液中黄芪甲苷可能是其作用的有效成分之一; 3.黄芪甲苷通过使GSK-3β失活而抑制mPTP开放,阻止氧化应激损伤; 4.黄芪甲苷通过产生NO激活cGMP-PKG信号转导通路使GSK-3p失活,进而阻止mPTP开放; 5. PI3K/Akt信号通路可能参与黄芪甲苷产生NO的作用。……   
[关键词]:黄芪;黄芪甲苷;抗氧化活性;糖原合成酶激酶3β;线粒体通透性转移孔
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:延边大学2011年