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水稻水分胁迫相关基因克隆及功能验证

周立国

  水稻是全世界最主要的粮食作物之一,但是水稻生产越来越受到水资源缺乏的限制。农业是用水大户,而水稻生产用水量占我国全部农业用水的70%,耗费了过多的淡水资源,这已经成为制约我国工农业发展的一个瓶颈。因此,开展对节水抗旱稻(WDR)研究是大势所趋。目前,虽然传统育种方法可以有效提高水稻抗旱性,但是对植物的抗旱机理了解不多,难以取得很大突破。由于植物的抗旱性十分复杂,涉及大量的基因表达与调控,必须不断发掘水稻抗旱相关基因,深入研究这些抗旱基因的功能,从而一方面明确水稻抗旱的分子机制,另一方面,为节水抗旱稻新品种选育提供基因资源。 本研究首先对土壤中栽培的水稻进行自然断水处理,提取不同时期叶片中的总RNA;通过植物miRNA芯片和水稻全基因组mRNA表达芯片,扫描分析其与正常栽培水稻间的差异。对2个候选基因OsI17、OsDr1进行了克隆和表达分析。通过对超表达OsI17基因水稻植株的抗逆性鉴定,深入研究了OsI17基因的功能,明确了OsI17基因在水稻抗逆响应中的作用。 本研究的主要结果如下: 1.为了深入了解水稻抗旱机制,我们用植物miRNA芯片扫描水稻IRAT109在分蘖期和幼穗分化期干旱胁迫下miRNA变化情况。实验结果显示,在所鉴定的30个受干旱胁迫而发生变化的植物miRNA中,11个下调表达的miRNA如miR170,miR172, miR397, miR408, miR529, miR896, miR1030, miR1035, miR1050, miR1088和miR1126以及8个上调表达的miRNA如miR395,miR474,miR845,miR851,miR854,miR901,miR903和miR1125是首次发现受干旱胁迫诱导的植物miRNA; ath-miR170和ath-miR396家族都表现严格下调表达, ptc-miR474与ath-miR854a表现严格的上调表达。这些发现对于进一步揭示水稻抗旱的分子调控机制以及利用基因工程手段改善水稻的抗旱性具有重要的价值。 2.运用水稻全基因组表达芯片分析了IRAT109在正常水分和干旱胁迫下基因表达的差异。我们发现了一系列与干旱胁迫响应有关的基础代谢途径,其中变化最明显的是碳固定途径。这显示了干旱胁迫下碳-水化合物合成代谢的适应性调节在水稻抵御干旱过程中起重要作用。 3.采用qRT-PCR定量分析了候选基因OsDr1和OsI17基因在不同的非生物逆境处理下的表达谱变化,发现它们的表达受到ABA、水杨酸、茉莉酸、H202等激素,以及干旱、高盐、低温等逆境胁迫的诱导。 4.应用RT-PCR方法克隆了OsI17基因含全长ORF的cDNA序列,并且构建了该基因的超表达、抑制表达等遗传转化载体,蛋白亚细胞定位载体,并导入到水稻中,获得了转基因材料。 5.OsI17基因表达蛋白含有一个AT-hook和一个功能未知的保守结构域DUF296。DUF296是在原核生物和植物中广泛存在的保守结构域,其蛋白定位于细胞核,与核基质及染色质MARs区相结合。AT-hook模体和DUF296结构域都具备核定位功能。 6.通过酵母双杂交实验验证,OsI17基因表达蛋白(或其DUF296结构域)具有同源蛋白结合功能,即OsI17蛋白可以通过DUF296结构域相互结合形成同源聚合物,发挥其结合及调整染色质构型的功能。 7.以35S启动子诱导的OsI17基因超量表达转基因水稻,在干旱胁迫下其叶绿素含量提高,叶绿素a/b比值降低;转基因水稻叶片中POD比活力提高,植株对ROS的清除能力增强;旱胁迫下生长的转基因材料小维管束数目显著高于WT水稻(t检验,p<0.05),泡状细胞组数目也有所增加;离体叶片持水能力和叶片相对含水量提高。由此,OsI17基因提高了水稻的耐旱性和避旱性。 8.全基因组表达芯片分析发现,在超表达OsI17转基因植株中,植株表达谱发生了变化。其中,变化最显著的代谢途径是PSⅡ系统,这一变化使植株在干旱胁迫条件下的光系统稳定性提高,为植株抵御逆境胁迫提供了更充足的物质和能量基础,从而改善了植株在水分胁迫下的生长状况。 9通过对转基因植株苗期高盐、低温、干旱筛选,证明OsI17基因能明显增强水稻的抗逆性,提高水稻在高盐低温以及干旱等胁迫条件下的生存能力及胁迫后的恢复能力。成株期抗旱鉴定试验证明,与野生型水稻相比超量表达OsI17基因的水稻,结实率提高了17%~23%,单株产量提高了27%以上,生物学产量提高了25%~50%,百粒重增加了29%以上;根容量和干重明显提高,根系性状得到改善。 10.OsI17基因启动子序列在野生稻和普通栽培稻中存在多样性。进化树分析表明了籼、粳稻以及野生稻之间可能的遗传进化关系,提示在野生稻材料中就已经开始出现籼、粳亚种的分化。 11.用5 -RACE和3 -RACE方法,克隆了OsDr1基因的全长序列,确定了基因的转录起始和终止位点。定量实验表明,OsDr1基因受多种逆境诱导上升表达;受光照诱导和调节,并且其在24h光周期内呈节律性变化。……   
[关键词]:非生物逆境;干旱胁迫;DUF296;OsI17;PSⅡ;抗逆性;水稻
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年