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犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制

刘波波

  犬瘟热(Canine distemper, CD)是犬或者其他易感动物感染犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)所引发的一种高度传染性和致病性疾病。目前,在我国由CDV引起的犬瘟热广泛流行,是危害养犬业最为严重的传染病之一。本研究根据CDV的细胞培养特性,采用异种病毒特异性血清阻断法,选用Vero细胞从犬二联弱毒活苗样品中分离获得一株犬瘟热(CDV)弱毒株。病毒在Vero细胞上传代培养后,能够引起细胞出现园缩、聚集、拉网、坏死等特征性的病变过程。病变细胞经RT-PCR鉴定CDV,结果显示阳性。病毒理化试验表明,56℃30min CDV可被灭活,pH7.0~8.0对病毒活性没有影响,pH4.0以下和pH10.0以上病毒活力大大降低。CDV有囊膜,氯仿处理可让其失去活性,病毒核酸型试验表明,CDV为RNA病毒,凝集试验显示,CDV不与鸡、猪、绵羊及兔红细胞发生凝集反应。经测定,该CDV弱毒株的毒价为10-6.25/mL TCID50。 以CDV Onderstepoort毒株的细胞培养液经PEG沉淀法纯化浓缩后作为免疫原,免疫6-8周龄的BALB/c雌性小鼠。经过3次皮下注射免疫后,再进行尾静脉加强免疫,3d后处死小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0做融合。用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选能够分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。经过反复的亚克隆筛选,最后得到5杂交瘤细胞株,均能够稳定地分泌抗CDV的单克隆抗体。分别命名为:1G5、2D7、3B6、4C7和4G5。5株单抗对CDV均有较高的特异性,和犬腺病毒Ⅱ型、犬细小病毒之间没有交叉反应。间接免疫荧光试验结果显示,5株单抗和感染了CDV的Vero细胞均能发生反应。5株杂交瘤细胞的腹水效价分别为1G5>100x210、2D7>100×29、3B6>100×27、4C7>100×28、4G5>100×210,细胞培养上清效价为28-29。5株单克隆抗体重链均属于IgG 1,轻链均属于K链。……   
[关键词]:犬瘟热病毒;分离;鉴定;单克隆抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2011年