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小麦逆境应答基因TaSnRK2.8的克隆与分析

张洪映

  小麦是世界上主要的粮食作物之一,干旱、盐和极端气候等逆境因子是限制小麦产量和品质提高的重要因素。挖掘和利用小麦逆境应答基因资源是应用现代基因工程技术改良小麦抗逆性的前提和基础,对于深入了解植物抗逆机制具有重要意义。蛋白质的可逆磷酸化是在逆境条件下植物体内能量代谢和逆境信号传递的重要机制。据报道,蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族2 (Sucrose non-fermenting1-related protein kinase 2, SnRK2)在逆境信号传递途径中具有重要作用。 本研究通过筛选本实验室构建的小麦水分胁迫应答cDNA文库,获得小麦SnRK2.8基因的EST序列,通过电子克隆的方法获得了小麦TaSnRK2.8基因的全长cDNA序列。通过研究其表达特性、亚细胞定位、染色体定位、单核苷酸多态性和启动子序列,并结合转基因功能验证结果,初步揭示TaSnRK2.8在逆境胁迫下的表达模式、抗逆功能及可能的信号通道。主要研究结果包括: 1.小麦TaSnRK2.8基因的cDNA序列全长为1431 bp,包含一个1101 bp的开放阅读框,编码含367个氨基酸的多肽。预测TaSnRK2.8蛋白同时存在丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶催化结构域。氨基酸序列比对结果表明,TaSnRK2.8蛋白分子量约42 kDa,等电点为4.87,与玉米、水稻和拟南芥中的直系同源基因的相似性分别为94%、94.8%和76.5%。聚类分析结果表明,TaSnRK2.8基因属于SnRK2家族第三亚族成员。 2.组织表达分析结果表明,TaSnRK2.8基因在小麦根部的表达量最高,其次为茎部,在叶片和穗中的表达量较低。TaSnRK2.8在胁迫处理下的表达分析结果表明,该基因受ABA、高盐、高渗和低温胁迫诱导表达,且在不同胁迫条件下基因的表达模式不同,其对各诱导条件的敏感度为:高渗>低温>ABA>高盐。 3.亚细胞定位及转拟南芥检测结果均表明,TaSnRK2.8基因在细胞膜、细胞质和细胞核中均有分布。 4.转基因功能验证结果表明,TaSnRK2.8过表达后可以促进植株根部的生长发育,增加细胞内的渗透物质,这些变化有利于根对土壤水分和养分的吸收,从而提高植物细胞膜在逆境胁迫条件下的稳定性,增强叶片的保水能力及光合能力等,进而提高植物的耐盐、抗旱和耐低温能力。此外,TaSnRK2.8过表达植物体内的可溶性糖含量显著降低,表明该基因在植物糖代谢过程中起重要作用。通过qRT-PCR研究TaSnRK2.8转基因株系中其它抗逆相关基因的表达量变化,结果表明,TaSnRK2.8转基因株系中的ABA合成相关基因(ABA1, ABA2)、ABA信号传递相关基因(ABI3, ABI4, ABI5)和逆境诱导基因(CBF1, CBF2, CBF3, RD20A, RD29B)均上调表达,其中CBF1、CBF2和CBF3为非ABA依赖型基因,RD20A和RD29B为ABA依赖型基因。 5. TaSnRK2.8基因组序列长度长约6.1 kb,包含9个外显子、8个内含子。其在普通小麦基因组中至少存在两种基因型TaSnRK2.8-A和TaSnRK2.8-B。利用中国春小麦缺四体系将TaSnRK2.8-A定位于小麦5A染色体上。分析165份小麦材料TaSnRK2.8-A-C序列的单核苷酸多态性,共检测到3个核苷酸变异,全部为转换,无插入缺失(InDel),SNP的频率为1 SNP/250 bp。核苷酸多样性(π)为0.00068,基于分离位点数目的多样性θw值为0.00070。其中,3′端UTR区的核苷酸多样性最高,次之为内含子区,外显子区的核苷酸多态性最低。中性测验结果表明TaSnRK2.8-A-C序列符合中性进化,这些遗传变异可能是突变-遗传漂变的结果。TaSnRK2.8-A-C序列等位变异(5917 bp, A→G)与群体性状的关联分析结果表明,该基因与糖代谢相关,进而影响小麦株高、叶宽、生物量和抽穗期等生长发育相关的性状,同时也与抗旱指数相关。同时,就A/G等位变异位点而言,A基因型是一种优异的等位基因类型。 6.分离了TaSnRK2.8基因上游1797 bp的启动子序列,该序列富含A/T碱基,如TATA-box、CAAT-box、ABRE、HSE、TC-rich repeats、LTR及C-repeat/DRE等顺式作用元件。通过对TaSnRK2.8启动子序列5′端四个连续缺失片段对GUS基因的驱动能力分析,发现只有Dp1870能够激活下游GUS的表达,且仅在转基因植株的叶柄和茎部表达,在叶片及根部均无表达。GUS荧光定量分析结果显示,在非胁迫条件下Dp1870驱动能力约为35S强启动子0.16~0.35倍。 本文的研究结果表明,小麦蔗糖非发酵相关蛋白激酶TaSnRK2.8参与了植物体内糖代谢及抗逆信号传递途径,其过表达后可以显著增强植物的抗逆性。……   
[关键词]:小麦;TaSnRK2.8基因;非生物胁迫;单核苷酸多态性;启动子
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2011年