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重组谷氨酰胺转胺酶的原核表达研究

张莹

  谷氨酰胺转胺酶,又称转谷氨酰胺酶(Transglutaminase,简称TGase或TG,全称:protein-transglutayltransferase, EC.2.3.2.13),其系统名称为蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺基转移酶。TG作为一种新型酶制剂,在食品工业、医药工业中有着重要作用,其应用前景广阔,受到了国内外学者的广泛关注。20世纪90年代以来,日本将微生物来源的谷氨酰胺转胺酶(MTG)商品化并获得巨大经济效益,国内,TG的研究和开发尚处于起步阶段。本实验室从土壤中筛选出一株高产谷氨酰胺转胺酶的菌株,鉴定为灰色轮丝链霉菌(Streptomyces griseoverticillatus),命名为Streptomyces H197,其发酵液中MTG酶活最大可达到1.74U/mL。 为了促进我国谷氨酰胺转胺酶的产业化生产及应用开发,运用基因工程手段,以Streptomyces sp H197染色体DNA为模板,设计引物扩增TG产酶基因,并对产酶基因进行分析,构建表达质粒并转化至表达载体。 实验表明,pET30α与E.coliBL21(DE3)宿主菌所构成的表达系统经IPTG诱导,主要生产包涵体形式的重组谷氨酰胺转胺酶蛋白。根据实验确定其最优表达条件为摇菌转速250 r/min,IPTG终浓度1.0 m moL/L,37℃时诱导培养4 h。诱导条件优化后,目的蛋白表达量增加10%。 粗提包涵体蛋白后,加入Triton X-100、溶菌酶等洗涤粗酶,有助于除去部分杂蛋白。重组MTG以融合蛋白形式表达,由于其含有His-tag,故利用亲和层析法进行纯化,提高目的蛋白纯度同时去除融合蛋白中的非目的片段。通过透析法及上柱法,使包涵体蛋白恢复生物学活性,分别测得酶活为0. 42U/ml、0.71U/ml,比活为0.182U/mg、0.236U/mg。结果显示,上柱法比透析法复性效率高。 为了达到工业化生产的目的,本文对其可溶性表达策略进行了初步探索。其一,选用其他诱导剂替代IPTG。乳糖作为IPTG的类似物,其价格廉价、无毒无害,进行诱导表达目的蛋白。结果表明,在乳糖的诱导下,重组谷氨酰胺转胺酶蛋白主要为可溶性表达,但表达量明显减少。其二,采用低温诱导策略。分别于不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、37℃)下对重组菌株进行IPTG诱导。结果显示,30℃下,目的蛋白以可溶性形式表达的量(2.0801mg/ml)最大,但与包涵体形式表达的产量相比,还是明显减少。以上结论可作为工业化生产重组谷氨酰胺转胺酶的实验室基础。……   
[关键词]:微生物谷氨酰胺转胺酶;原核表达;包涵体;复性;可溶性表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中南民族大学2011年