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家蚕第二隐性赤蚁基因(ch-2)的图位克隆

张蕊

  着色是动物最具多样化的特征之一,体色艳丽,形状奇特的蝴蝶和部分蛾类,具有很高的观赏价值。体色的研究对探讨昆虫遗传多态性、适应机制及生物进化等具有重要的意义。家蚕的色彩突变涉及家蚕的各个生长时期,胚胎期,幼虫期、蛹期、成虫期,包括蚕茧也具有丰富的颜色变化。不同的基因变异导致控制家蚕体内的各种黑色素、蝶啶、眼黄素等在表皮细胞和真皮细胞中的积累和相互作用,可以形成不同体色突变。目前已发现100多种突变都与着色模式异常相关,因此,研究家蚕体色形成机制,有助于为色素模式的遗传学基础研究提供丰富资源,使人们深层次认识色素功能,同时为家蚕品种资源的多样性分析提供了依据。 第二隐性赤蚁基因(ch-2)是少数只在蚁蚕时期显现出可辨别表型的体色突变型之一,作为标志性基因,本研究利用SSR、STS和CAPs分子标记技术和siRNA干扰技术,对其进行图位克隆和功能补偿验证,其主要内容及结果如下: 1.对ch-2基因的初步定位和连锁分析 供试家蚕品种正常黑蚁P50和突变体赤蚁ch-2品种k04均由中国农业科学院蚕业研究所提供。用k04和P50作为亲本组建F1代及BC1回交群体(k04×p50)×k04和k04×(k04×P50),分别记作BC1F和BC1M。基于雌性家蚕的W与Z染色体不发生交换的特点,采用此两种回交群体通过已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱用BC1F群体进行连锁分析,用BC1M群体构建遗传连锁图,寻找与ch-2基因连锁的标记,结果显示在第18连锁群上发现7个多态SSR标记(S1804、S1807、S1808、S1809、S1812、S1814 and S1819),重新设计微卫星位点的引物,结果在S1804和S1807附近找到2个新的多态SSR标记ZR1807和ZR1817,这9个标记在BC1F群中的电泳谱中所有黑色个体均表现出与F1相同的杂合带型;而所有赤蚁带型与k04一致,为纯合型;用BC1M群体采用作图软件Mapmaker 3.0,根据整个数据阵计算重组值(LOD取5.0),绘制出ch-2基因的分子连锁图。绘制的遗传连锁图的遗传距离为70.7cM,ch-2基因位于中间69.6cM处,S1814和S1819与ch-2基因距离最近,与ch-2基因的距离分别是7.9cM和1.1cM。 2对第二隐性赤蚁基因ch-2的精细定位及ch-2基因全长的获得 经与家蚕基因组数据库进行比对,S1814位于家蚕基因组精细图的nscaf2902的1.526Mb处,而S1819不能在基因组精细图中比对到序列,说明S1819的序列位于已知的家蚕基因组精细图中的scaffold外部,这与其位于遗传连锁图的尾端是符合的,说明S1819所在区域的序列还没有能够被测通或者没有能够被正确拼装。于是我们在nscaf2902和nscaf2901上用Primer.primer5.0设计更多的STS和CAPS引物的标记,通过测序酶切PCR产物将ch-2锁定在300kb以内的区域,通过Blast程序搜索,经同源序列比对,发现预测基因BGIBMGA008245-TA表皮蛋白(CPG6 )基因和BGIBMGA008268-TA基因,可能与着色相关。查询数据库,并了解该基因的功能,将目标锁定为BGIBMGA008245-TA表皮蛋白(CPG6)基因。通过对P50表皮进行5’和3’RACE-cDNA扩增,利用DNAMAN拼接得到了ch-2基因的全长。 3.候选基因功能验证用家蚕品种正常黑蚁P50和突变体赤蚁ch-2品种k04的不同催青天数的蚕卵,液氮速冻后提取RNA,反转录为cDNA后进行普通PCR扩增,凝胶回收PCR产物,克隆测序,比较亲本间的序列差异。结果发现表皮蛋白(CPG6)的表达在催青第一天和第四天均无差异,而第九天在突变体中存在156bp左右的缺失表达,根据表皮蛋白(CPG6)在突变体中的表达差异性,对差异序列进行SiRNA设计,注射到经过不同时间催青处理的蚕卵中进行催青,并对孵化的卵数进行统计,对未孵化的卵进行解剖,发现了赤色的蚁蚕。……   
[关键词]:家蚕;SSR;第二隐性赤蚁基因;基因定位;候选基因;功能验证
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江苏科技大学2011年