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神经元—星形胶质细胞相互调控在神经病理性痛及镇痛中的作用

汪伟

  【背景】 外伤、神经压迫、感染以及神经退行性病变常常导致神经病理性痛。然而由于对神经病理性痛的诱导和维持的机制没有全面的认识,目前尚缺乏有效的镇痛手段。长期以来,神经病理性痛的研究一直围绕着“神经元为中心”的学术体系而开展的。近十年来,胶质细胞在疼痛的作用引起越来越多的关注。我们的前期研究明确了脊髓背角星形胶质细胞在神经病理性痛不同时程的状态改变以及与疼痛的相关性,然而还有很多问题亟待解决。本研究在大鼠神经病理性痛模型动物上,综合利用神经行为学、分子神经生物学和形态学等方法,研究了神经元-星形胶质细胞相互作用对脊髓背角局部环路可塑性的调控及其在神经病理性痛中的作用,并在此基础上进一步观察干预神经损伤后星形胶质细胞和神经元的相互调控对疼痛的影响。结合上述基础研究和应用研究两方面的相互印证,在进一步阐明神经病理性痛的发病机制的同时,为其治疗提供新的策略。 【目的】 探讨神经元-星形胶质细胞相互调控在神经病理性痛发展中的作用及相关的镇痛策略。 【方法】 (1)建立大鼠脊神经结扎(SNL)神经病理性痛模型;(2)运用von Frey纤维丝检测大鼠SNL后机械性缩足阈值的改变;(3)运用Hargreaves热辐射法检测SNL后热缩足潜伏期的改变;(4)免疫荧光组织化学方法检测脊髓背角星形胶质细胞GFAP和氨酸转运体-1(GLT-1)的表达变化;(5)运用免疫荧光双重标记方法观察GLT-1和GFAP的双标情况;(6)大鼠鞘内置管给予c-fos反义寡核苷酸探针(ASO)或星形胶质细胞毒素L-AA;(7)运用von Frey纤维丝检测给予c-fos ASO或L-AA后大鼠机械性缩足阈值的改变;(8)免疫荧光组织化学方法检测脊髓背角星形胶质细胞GFAP和Fos的表达变化;(9)运用免疫荧光双重标记方法观察Fos和GFAP、NeuN的双标情况;(10)Western blot检测SNL后JNK磷酸化的改变;(11)免疫荧光双重标记方法观察pJNK和GFAP的双标情况;(12)大鼠鞘内置管给予NMDA、pJNK抑制剂SP600125、NMDA受体非选择性拮抗剂MK-801、NR2B亚单位选择性拮抗剂Ro25-6981和ifenprodi、nNOS选择性抑制剂7-NINA以及鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ;(13)运用von Frey纤维丝检测给予各种药物后大鼠机械性缩足阈值的改变;(14)Western blot检测给予各种药物后大鼠脊髓背角JNK磷酸化的改变;(15)实时荧光定量PCR检测给予各种药物后大鼠脊髓背角JNK相关的细胞因子和趋化因子包括IL-1beta、TNF-alpha、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)以及IL-6等mRNA表达;(16)大鼠鞘内置管给予不同剂量氯胺酮、星形胶质细胞毒素L-AA以及两种药物联用;(17)运用von Frey纤维丝检测各种给药对大鼠机械性缩足阈值的影响(;18)Western blot检测给予各种药物后大鼠脊髓背角NMDA受体NR1亚单位磷酸化的改变;(19)免疫荧光组织化学方法检测给予各种药物后脊髓背角星形胶质细胞GFAP的表达变化;(20)运用von Frey纤维丝检测预防性和治疗性腹腔注射雷公藤提取物T4对SNL大鼠机械性缩足阈值的影响;(21)运用Hargreaves热辐射法检测预防性和治疗性腹腔注射雷公藤提取物T4后SNL大鼠热缩足潜伏期的改变;(22)免疫荧光组织化学方法检测给予T4对SNL大鼠脊髓背角GFAP、小胶质细胞标记物OX42以及神经元标记物NeuN的表达变化;(23)Western blot检测T4对SNL大鼠脊髓背角丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)磷酸化的影响;(24)实时荧光定量PCR检测T4对SNL大鼠脊髓背角痛相关的主要细胞因子、趋化因子mRNA表达的影响。 【结果】 (1)SNL后,同侧脊髓背角星形胶质细胞GFAP表达显著升高,荧光密度显著高于损伤对侧;(2)GLT-1的表达也明显高于对侧;免疫荧光双重标记显示,GLT-1几乎完全表达在GFAP阳性的星形胶质细胞;(3)GFAP的表达在术后1 d时几乎没有显著的变化,3 d开始明显升高,在7 d时达到高峰,直至21 d时仍维持在较高水平;(4)损伤同侧脊髓背角GLT-1的表达呈现出先升高后降低的双相改变:术后1 d时显著高于对照组,3-5 d时达到高峰,术后7 d时恢复到正常水平,而在14 d和21 d时则显著低于正常水平;(5)SNL诱导Fos蛋白和星形胶质细胞GFAP在脊髓背角的表达;(6)鞘内给予c-fos ASO或L-AA均能防止SNL诱导的疼痛行为反应;(7)c-fos ASO能够抑制SNL后脊髓背角星形胶质细胞GFAP的表达;(8)LAA缩短SNL后脊髓背角神经元Fos蛋白表达时程;(9)SNL后7 d pJNK以及GFAP在神经损伤同侧的脊髓背角表达显著升高;(10)免疫荧光双重标记显示pJNK在脊髓背角与GFAP几乎完全共存;(11)pJNK抑制剂SP600125从SNL 3 d开始能够显著抑制SNL诱导的机械性触诱发痛,这种效应持续到术后10 d(;12)NMDA受体非选择性拮抗剂MK-801以及NR2B亚单位选择性拮抗剂Ro25-6981和ifenprodil均能有效抑制SNL诱导的机械性触诱发痛和脊髓背角JNK磷酸化;(13)免疫荧光双重标记显示NR2B亚单位在脊髓背角与神经元标记物NeuN大量共存,而NR2B几乎没有在星形胶质细胞表达;(14)NMDA多次注射诱导pJNK在脊髓背角的高表达,免疫荧光双重标记显示NMDA诱导的pJNK均表达在星形胶质细胞;(15)SNL诱导的JNK活化依赖于nNOS,而不依赖于nNOS敏感性的鸟苷酸环化酶(GC)途径;(16)阻断NMDAR-nNOS通路抑制JNK相关的细胞因子mRNA表达;(17)鞘内注射NMDAR阻断剂氯胺酮具有显著的镇痛效果,而且该效应呈剂量依赖性,氯胺酮的镇痛效果出现较快(数分钟),但是持续的时间较短;(18)鞘内注射LAA的镇痛效果出现较慢,但是持续的时间较长;联合给药的作用效果很快即可诱导,并且作用稳定而持久;(19)氯胺酮和LAA联合给药时,LAA能够促进氯胺酮对NR1磷酸化的抑制作用,而氯胺酮能够促进LAA对星形胶质细胞的作用;(20)提出同时以神经元和星形胶质细胞为靶点的联合镇痛手段;(21)预防性腹腔注射雷公藤提取物T4抑制神经病理性痛的产生,治疗性腹腔注射T4能够逆转已经形成的神经病理性痛;(22)T4能够抑制SNL后脊髓背角胶质细胞的活化,但对神经元及正常状态下的胶质细胞没有显著作用;(23)T4处理抑制SNL后脊髓背角丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的活化;(24)腹腔注射T4抑制SNL后脊髓背角的细胞因子和趋化因子包括IL-1beta、TNF-alpha、MCP-1以及IL-6等mRNA表达。 【结论】 (1)SNL后,同侧脊髓背角星形胶质细胞GFAP和GLT-1的活跃改变,提示星形胶质细胞与神经病理性痛的发生发展密切相关。 (2)SNL诱导神经元和星形胶质细胞的显著活化;阻断神经元或星形胶质细胞的活化能够缓解疼痛,同时分别下调对方的活性;提示在神经病理性痛发展的过程中,神经元和星形胶质细胞的活化相互促进,两者以正反馈的方式促进神经病理性痛的发生发展。 (3)SNL后脊髓背角星形胶质细胞JNK的磷酸化水平显著升高并参与SNL诱导的机械性触诱发痛;阻断NMDAR以细胞间间接作用的方式抑制脊髓背角JNK磷酸化;SNL诱导的JNK活化依赖于nNOS,但不依赖于nNOS敏感性的GC途径;阻断NMDAR-nNOS通路抑制JNK相关的细胞因子mRNA表达;提示NMDAR-nNOS通路介导了疼痛状态下神经元向星形胶质细胞的信号传递。 (4)鞘内联合给予氯胺酮和LAA能快速、稳定、持久地抑制疼痛行为;氯胺酮和LAA能够抑制NR1磷酸化和星形胶质细胞的活化;在此基础上提出同时以神经元和星形胶质细胞为靶点的联合镇痛手段。 (5)腹腔注射雷公藤提取物T4能够预防、治疗神经病理性痛;T4能够抑制SNL后脊髓背角胶质细胞的活化、MAPK的磷酸化、细胞因子和趋化因子的表达;提示雷公藤提取物T4可能具有良好的镇痛前景。……   
[关键词]:神经病理性痛;星形胶质细胞;神经元;镇痛;脊髓背角
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2011年