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白斑综合征病毒对锯缘青蟹的致病性及致病机理研究

刘问

  锯缘青蟹(Scylla serrata Forskal)俗称青蟹,是我国重要的海水养殖蟹类。近年来,浙江、福建、广东等青蟹主要养殖地区出现了严重的青蟹病害。2006~2008年对浙江省养殖青蟹的发病原因和流行病学调查发现,白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)在病蟹中的检出率为34.82%,提示WSSV与青蟹发病可能存在较大相关性。 为进一步研究WSSV对青蟹的致病性和致病机理,作者采用白斑综合征病毒悬液,分别以1∶10、1:100、1:1000、1∶10000浓度注射感染健康青蟹,结果表明1:10、1:100感染组的青蟹死亡率达100%,1:1000感染组死亡率为66.7%,1:10000感染组死亡率为38.9%。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)确定WSSV攻毒悬液中的病毒浓度,计算出WSSV对青蟹的半数致死量(LD_(50))为1.10×10~6拷贝/只(7.34×10~3拷贝/g组织)。PCR检测感染组濒死青蟹的血淋巴,显示感染组死亡青蟹的WSSV检出率为100%,表明WSSV对青蟹有很强的致病力。 分析WSSV感染濒死蟹的血清酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)等主要酶指标,发现病毒感染后青蟹的PO、POD和SOD活力明显低于对照组,其中PO比对照组下降了84%、POD比对照组下降78.6%、SOD比对照组下降3.82%,提示WSSV感染可能导致机体免疫防御机能和抗氧化能力下降。而ALP、GPT和GOT的活力则明显高于对照组,其中GPT和ALP分别比对照组升高了226.6%和173.5%,GOT升高了38.3%,提示病毒感染致使青蟹组织器官损伤,从而造成机体功能严重受损,最终导致青蟹死亡。 透射电镜观察WSSV感染蟹的鳃上皮细胞,可见细胞核中存在大量杆状、椭球状的病毒粒子。组织病理分析显示,鳃上皮细胞的细胞核明显肥大,并可见较多嗜碱性病毒包涵体。用WSSV单克隆抗体,对感染蟹进行免疫组化分析,表明WSSV主要侵染青蟹的鳃、甲壳下表皮、心脏、肠、胃等组织的上皮细胞。 为进一步研究WSSV对锯缘青蟹的分子致病机理,采用双向电泳(2-DE)技术分析了感染WSSV的青蟹血清的蛋白表达谱,检测到26个显著差异表达的蛋白质点;采用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,成功鉴定了22个显著差异表达的蛋白质点(12个蛋白质点的表达上调、10个蛋白质点的表达下调),表达上调蛋白包括血蓝蛋白亚单位1(hemocyanin subunit 1)、血蓝蛋白亚单位(hemocyanin subunit)、α-2巨球蛋白(alpha 2-macroglobulin)、热休克蛋白70(heat shock protein 70)、细胞溶质锰超氧化物歧化酶(cytosolic manganese superoxide dismutase)、过氧化氢酶(catalase)、假血蓝蛋白(cryptocyanin)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)、精氨酸激酶(arginine kinase)和核糖体蛋白S28(ribosomal protein S28);表达下调蛋白包括酚氧化酶原(prophenoloxidase)、热休克蛋白90-2(heat shock protein 90-2)、假血蓝蛋白1 ( cryptocyanin 1 )、3-磷酸甘油醛脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、肌动蛋白(actin)、原肌球蛋白(tropomyosin)、突触相关蛋白(synaptosomal-associated protein, putative)和转座酶(transposase)。这些差异蛋白介导了机体的免疫防御、抗氧化防御、应激、氨基酸代谢及糖代谢等反应,对差异蛋白在WSSV致病过程中的作用机制的分析探讨,为进一步阐明WSSV对青蟹的分子致病机理、寻找与病疾相关的生物标记物及有效的疾病防控方法提供了重要的理论依据。……   
[关键词]:锯缘青蟹;白斑综合征;致病性;致病机理;蛋白组学
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:宁波大学2010年