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抗伪狂犬病毒单克隆抗体的制备及gB基因编码蛋白抗原表位的表达

王大伟

  猪伪狂犬病( Pseudorabies , PR)是由猪伪狂犬病病毒( Pseudorabies virus, PRV)引起的一种高度接触性、急性传染病。PRV属疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科,我国1948年首次报道猫的伪狂犬病,根据2006年夏的统计结果,PR流行范围已扩大到31个省、市(区),包括香港和台湾在内,对我国的养殖业造成了巨大的经济损失,因此,建立有效的诊断检测方法对控制和消灭PR具有重要的意义。本研究筛选出分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株;利用原核表达系统表达了PRVgB基因主要抗原区蛋白。 1、PRV杂交瘤细胞株的筛选及单抗制备: 将伪狂犬病毒Batha株接种于BHK-21细胞,病毒增殖后,将细胞培养物反复冻融三次后,收集病毒,利用差速离心法和蔗糖密度梯度离心法分离纯化病毒,利用纯化的伪狂犬病毒免疫BALB/c小鼠,经三免后,取合格小鼠的脾脏细胞与NS0骨髓瘤细胞进行融合,利用ELISA和免疫组化方法筛选杂交瘤细胞,采用有限稀释法对其进行亚克隆,最终获得2株稳定分泌抗猪伪狂犬病毒的杂交瘤细胞株,即2B2-C1和3F1-A1。特异性实验结果表明:2B2-C1和3F1-A1不与猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及正常BHK-21细胞反应,特异性良好。两株PRV单抗的获得,为进一步建立特异、敏感、准确快速的PRV检测方法打下了基础。 2、PRV gB基因主要抗原区的克隆及原核表达: 依据Genbank发表的PRV gB基因序列,设计一对特异引物,通过PCR方法扩增出PRV gB基因片段(264bp),并将其克隆于pET-28a表达载体,构建后的表达质粒命名为pET-28a-gB,将pET-28a-gB转入BL21工程菌,通过IPTG诱导培养后,经SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明, gB基因片段在BL21工程菌中得到了高效表达,表达蛋白条带大小约为16 kDa,该表达蛋白能够被PRV阳性血清识别。PRV gB基因主要抗原区的表达为gB蛋白单抗的筛选及建立gB抗体检测奠定了基础。……   
[关键词]:伪狂犬病毒;单克隆抗体;免疫组化;gB基因
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河南科技大学2011年