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记忆缺失性贝毒免疫胶体金快速检测试纸条的研制

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  记忆缺失性贝毒(ASP)是有毒赤潮硅藻分泌产生的毒素,其主要活性成分软骨藻酸(domic acid, DA)是一种氨基酸类毒素。海洋贝类通过食物链的传递作用可在体内累积DA,人及海洋哺乳动物中毒之后,会干扰中枢神经系统,发生暂时性失去记忆甚至死亡。 胶体金免疫层析技术(colloidal gold immunochromatographic assay,GICA)是以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用原理,以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型检测方法。该方法具有操作简单、快速、分析结果易于判断,无需任何仪器、成本低廉等优点,适用于现场批量检测。近年来,胶体金免疫层析技术己成为当今发展最快速的免疫学检测技术之一,在毒素检测等领域得到了广泛的发展。 本研究采用单克隆抗体技术和胶体金免疫层析技术,制备快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条。取得了如下研究成果:1.软骨藻酸免疫抗原和包被抗原的制备 采用活泼酯法,将软骨藻酸与载体蛋白钼孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,制备了相应的免疫抗原DA-KLH和包被抗原DA-BSA,紫外扫描定性鉴定偶联成功,偶联比分别为1:25和1:16。 2.软骨藻酸单克隆抗体的制备 免疫抗原DA-KLH免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术成功制备2株能稳定分泌抗软骨藻酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚类分别为IgG1和IgG2a,通过体内诱生腹水法获得纯化后效价为1:64000的抗软骨藻酸单克隆抗体。 3.胶体金及软骨藻酸金标抗体的制备 采用柠檬酸三钠还原氯金酸法,成功确立了20nm胶体金的制备条件,并利用制备好的胶体金,对前述制备的抗软骨藻酸单克隆抗体进行了胶体金标记条件的摸索,成功确立了单克隆抗体的胶体金标记条件:最适pH是9.0,最适标记稳定量是9.72μg/mL胶体金,并制备金标抗体。 4.软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备 对软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的各项指标进行优化,并确立了最佳条件。最终选择SB06玻璃纤维素膜涂布4×稀释度的金标抗体构成胶体金结合垫;选择Millipore180 NC膜作为层析膜,羊抗鼠IgG(1mg/mL)和1μL包被抗原DA-BSA(0.867 mg/mL)喷涂在NC膜上,分别作为质控线和检测线;选用SB08玻璃纤维素膜作为样品垫;SX18吸水纸作为吸收垫;将胶体金结合垫、NC膜、样品垫和吸收垫组装成软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条 5.软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的应用 对胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度、特异性和稳定性进行测试,结果表明,试纸条检测时间不超过15 min,检测灵敏度达20 ng/mL(对于贝类食品相当于8μg/g贝肉),可以满足国际规定的20μg/g的安全限值。特异性强、重复性好,4℃下可保存6个月。该方法灵敏度高、简单快速,无需特殊仪器设备,适用于广大基层单位的现场和批量检测,有着良好的商业开发应用前景。……   
[关键词]:记忆缺失性贝毒;软骨藻酸;单克隆抗体;胶体金;免疫层析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:上海交通大学2011年