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人肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii数量和组成的研究方法的建立和应用

冯洁

  肠道菌群是人体内最复杂的共生微生物生态系统,无论是健康或疾病状态下,人体生理代谢都不可避免地受到肠道菌群结构变化的影响。 Feacalibacterium prausnitzii是人肠道中数量最占优势的细菌之一,占细菌总数的7%以上,并在人群中广泛分布。肠道细菌F. prausnitzii具有重要的生理功能:能够为肠上皮细胞提供能量;可以影响宿主多个代谢通路;可能通过甲胺类物质的代谢与胰岛素抵抗相关;具有抗肠道炎症的特性。但是该种菌严格厌氧且难于培养,因此,使用分子方法对该细菌在中国人群中的数量和组成进行分析,对解析F. prausnitzii与人体健康和疾病的关系具有重要的意义。 本研究首先比较3对基于16S rRNA基因、用于检测F. prausnitzii的引物(FPR-1-FPR-2、FPR-2F-Fprau645R和Fprau223F-Fprau420R)的特异性,选取特异性最好的1对用于后续定量和组成的研究。用Clustal X比对每个引物与F. prausnitzii和其他细菌的16S rRNA基因的序列。在Ribosomal Database Project(RDP)数据库中使用Probe Match工具比较每个引物匹配的Faecalibacterium spp.序列数目。利用本课题组建立的中国人粪便菌群的16S rRNA基因全长文库的7255个克隆序列,用Simulated PCR(SPCR)预测每对引物检测到的F. prausnitzii和其他细菌的克隆数;用3对引物分别对代表克隆进行PCR扩增。结果显示:引物Fprau645R的3’端最后一个碱基与非F. prausnitzii序列的错配度高于其它引物,它在RDP中匹配的Faecalibacterium spp.序列数占其匹配的细菌序列数的百分比(97.6%)显著高于其他引物。SPCR预测,3对引物检测到的F. prausnitzii克隆数均为1171左右;在检测到的非Faecalibacterium spp.克隆中,FPR-2F-Fprau645R主要是Subdoligranulum spp.,而FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R还有Oscillibacter spp.、Ruminococcus spp.和unclassified Ruminococcaceae等。真实PCR与SPCR的结果吻合。结果表明3对引物能检测到F. prausnitzii和Subdoligranulum spp.,FPR-2F-Fprau645R的特异性优于FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R。 接着,运用FPR-2F-Fprau645R这对引物,我们摸索了F. prausnitzii特异性的实时定量PCR方法,并建立了F. prausnitzii特异性的变性梯度凝胶电泳(DGGE)的分析方法,并用这两种方法调查了56个单纯性肥胖和57个正常体重成人(年龄、性别、居住地一一匹配,其中女性63人,男性50人)粪便中F. prausnitzii的数量和组成。 F. prausnitzii特异性实时定量PCR结果显示,女性肠道中F. prausnitzii的数量显著高于男性(P=0.005),其中在正常体重组,得到的结果同上,而在肥胖组并没有得到上述性别间的差异,提示F. prausnitzii在不同性别间存在数量差异。粪便F. prausnitzii的数量与体质指数(BMI)相关(R=0.214,P=0.023),提示F. prausnitzii与肥胖可能存在一定的关系。相比于正常体重志愿者,肥胖志愿者肠道中F. prausnitzii的数量较多,但是差异并不显著(P=0.101)。 F. prausnitzii类群特异性的PCR-DGGE方法对14个肥胖个体和13个正常体重对照个体进行了分析。发现两组人群的F. prausnitzii的组成没有明显的差异。 综上所述,FPR-2F-Fprau645R是检测粪便F. prausnitzii的特异性较好的引物。人粪便F. prausnitzii的数量具有性别差异,并与肥胖具有一定的关系。本研究利用新建立的F. prausnitzii特异性的PCR-DGGE方法,发现F. prausnitzii的组成在肥胖和正常体重人群间没有明显差异。……   
[关键词]:人体肠道菌群;肥胖;BMI;Feacalibacterium prausnitzii;实时定量PCR;Feacalibacterium prausnitzii特异性PCR-DGGE;血糖
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:上海交通大学2011年