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氧化还原体系对RNaseA包含体复性的影响

韩广杰

  在含二硫键蛋白质复性的过程中,二硫键的正确形成通常是复性的限速步骤,二硫键的错误形成也是引起蛋白质聚集而导致复性收率低下的重要原因。 为了开发辅助含二硫键蛋白质高效复性的方法,本研究将两种具有辅助二硫键快速生成功能的小分子4-巯基苯乙酸(ArSH)和己酰胱胺(HCA)组合成为新型的氧化还原系统(ArSH/ HCA),以RNase A为模型蛋白进行复性条件的优化,最终将优化的条件应用于RNase A包含体复性,并就复性效果与传统的氧化还原系统进行了比较。 经优化确定的最佳复性条件为在pH8.3 Tris- acetate溶液中,内含0.4M urea,1 mM EDTA,1 mM ArSH,0.25 mM HCA,可使0.3 mg·mL~(-1) 在上述工作的基础上,结合RNase A包含体复性实际情况进一步对复性条件进行优化之后,在pH8.3 Tris- acetate溶液中,内含1 M urea,1 mM EDTA,4 mM ArSH,0.5 mM HCA的条件下,复性1 h可使0.3 mg·mLRNase A复性3 h达到复性平衡,最终复性收率达到92%。若其它条件相同,以传统氧化还原体系(1 mM GSH/0.25 mM GSSG)辅助相同浓度的RNase A复性时,达到复性平衡需6 h,最终复性收率仅为65%。-1RNase A包含体复性收率达50%,5h复性达到平衡,最终复性收率约70%。而以GSH/GSSG、GSH/HCA为氧化还原体系复性RNase A包含体,复性速度很慢,活性低于35%。虽然在ArSH/GSSG辅助下RNase A包含体最终的复性收率也能达到60%,但是复性平衡时间为7 h。本文开发的复性方法较前人的工作得到了明显改善,RNase A浓度从0.12 mg mL~(-1)提至0.3 mg mL~(-1),复性平衡时间从24 h降至5 h,复性收率从50%提高至70%,基本实现了高收率,高浓度、快速的复性效果。……   
[关键词]:核糖核酸酶A;包含体;复性;芳香族类巯醇;己酰胱胺
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:天津大学2010年