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中华鳖暴发性败血症的研究

胡广洲

   对中华鳖(Trionyx sinensis)暴发性败血症进行了研究,该病是2005年来发生于浙江宁波等地区中华鳖生态养殖场的一种暴发性疾病,病鳖主要的症状为出血性败血,死亡严重。对中华鳖暴发性败血症流行情况,主要组织病理变化和超微病理变化进行了研究,确定了该病病原,并对病原进行了研究。 流行病学调查表明,中华鳖暴发性败血症主要流行浙江宁波等地区的中华鳖生态养殖场,病鳖主要为体重150-200 g的幼鳖,成、亲鳖也有患病感染。发病季节为6-10月份,其中6-9月份为发病高峰期,发病池塘10天内累积死亡率可达90-100%,主要的症状为出血性败血,常规药物进行治疗无效,给养殖生产带来很大经济损失。 对病鳖组织涂片,镜检观察未发现寄生虫。病鳖组织通过电镜检测病原,观察可见病鳖心、肝、肠及胃等组织内存在大量90-100 nm的球状病毒颗粒,未发现气单胞菌等的感染,且从病鳖组织中分离纯化到了大小、形态相同的病毒颗粒。用病鳖组织匀浆液和组织匀浆滤液对健康鳖进行回归感染,都可引起鳖死亡,死亡的中华鳖解剖观察结果与之前患病中华鳖症状基本一致,其中组织匀浆液攻毒组中华鳖死亡率比组织匀浆滤液组高15%。上述结果表明病毒是原发性病原,细菌加重病情。 组织病理研究结果表明,患病中华鳖肝脏、肠、胃均表现出非常明显的病理学变化。肝脏、肠、胃等组织细胞肿胀充血,排列松散,并可见破坏的血细胞,呈败血症状,胃、心等组织细胞出现空泡化,心脏中血细胞减少,肾小球失血萎缩,还有部分肾小球坏死解体、消失,肾小管破裂,脾髓中部分血细胞破裂。超微病理研究结果表明,患病中华鳖的肝脏组织细胞病变最为严重,在各组织细胞中均观察到了球状病毒颗粒。从各组织细胞的病理变化来看,主要表现为线粒体减少,嵴断裂,甚至呈空泡化,溶酶体增多,细胞发生坏死、凋亡。 使用SPF鸡胚对败血症病毒进行培养研究,采用卵黄囊接种法和羊膜腔接种法接种鸡胚,36℃培养。收获接种后第2-7天死亡的鸡胚,7天内不死的鸡胚第8天停止培养。对鸡胚的培养时间进行方差分析可知,实验组和对照组的鸡胚培养时间差异极显著(p<0.01),两种方法接种的鸡胚培养时间无显著性差异(p>0.05);在实验组鸡胚的卵黄囊膜中经电镜观察可见大量病毒,和病鳖组织中的病毒大小、形态基本相同;将实验组鸡胚制成攻毒液对中华鳖进行回归感染成功,死亡的中华鳖症状与该病例基本相同;并采用卵黄囊接种法对病毒进行两次传代培养,结果实验组和对照组的鸡胚培养时间差异均极显著(p<0.01)。上述结果表明鸡胚培养中华鳖球状病毒成功,卵黄囊膜接种法和羊膜腔接种法接种效果基本相同,病毒能够在鸡胚中传代培养。 对病毒的理化特性进行研究,结果表明病毒对热(56℃)、酸(pH 3.0)和碱(pH 11.0)表现不稳定;对脂溶剂(氯仿)敏感;紫外线照射30 min可使大部分病毒灭活。 对病毒进行了初步纯化,提取病毒DNA,采用6条随机引物,对病毒的核酸进行了扩增和测序初步研究,除两条引物没有扩增和测序成功外,共测得4条基因序列,Blastn结果表明,4条序列与Genebank中的序列同源性或覆盖率不高。4条序列中仅有1条氨基酸序列可以通读,Blastp结果表明该序列和甲基化酶家族基因同源。测序结果结合电镜观察结果,说明所测病毒应该是一种新病毒。 从病鳖体内分离到8株细菌,对细菌进行形态观察,结合16S rDNA序列分析鉴定8株细菌分别为为格氏乳球菌、假单胞菌、海氏肠球菌、屎肠球菌、人苍白杆菌、惰性嗜血杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和迟钝爱德华氏菌。对格氏乳球菌、弗氏柠檬酸杆菌和迟钝爱德华氏菌进行药敏试验发现,格氏乳球菌对青霉素等4种药物敏感,弗氏柠檬酸杆菌对头孢唑啉等13种药物敏感,迟钝爱德华氏菌对新霉素等3种药物敏感,药敏结果可对该病的治疗起到帮助。 采用16S rDNA分析方法,构建了病鳖体表和体内细菌克隆文库。结果表明,中华鳖体表和体内文库克隆子分别归为15和11类OTU,体表和体内菌群多样性较强,优势细菌类群分别为拟杆菌类群和变形菌类群,并在文库中检测到了几株益生菌和条件致病菌。……   
[关键词]:中华鳖;败血症;球状病毒;病理;鸡胚培养;测序;细菌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:宁波大学2010年