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大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶性表达策略

张丹萍

  本文以提高重组蛋白在大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶表达量为目的。首先以hIGF-1为目标蛋白,通过选择合适的策略来提高它在大肠杆菌中的可溶表达量;接着以eGFP为模式蛋白,通过采用富含分子伴侣的大肠杆菌抽提物来提高其在无细胞蛋白合成系统中的可溶表达量。 我们首先通过RT-PCR的方法从人体肝肿瘤组织中获得目标基因hIGF-1,并构建了表达质粒pET32-hIGF-1,接着分析了不同大肠杆菌宿主BL21 (DE3), Rosetta (DE3)和Rosetta-gami (DE3)对TrxA-hIGF-1可溶表达的影响。结果表明在大肠杆菌宿主Rosetta-gami (DE3)中,hIGF-1融合蛋白的可溶表达量最高。接着,我们对该重组大肠杆菌Rosetta-gami (DE3)/pET32-hIGF-1的蛋白表达条件进行了系统的优化,在最佳表达条件下,可溶性hIGF-1融合蛋白的表达量达到了最大值2.06 g/L。最后经过细胞破碎,蛋白纯化,肠激酶切割,释放出的成熟hIGF-1浓度达到了0.42 g/L。 对于大肠杆菌无细胞蛋白合成系统,本文采用转入分子伴侣质粒的重组大肠杆菌来制备富含分子伴侣的抽提物,并用它来构建无细胞蛋白合成系统。在该富含分子伴侣的无细胞蛋白合成系统中,目标蛋白eGFP的可溶表达量得到了显著提高。本文的研究工作将为提高重组蛋白在体内外的可溶表达量提供行之有效的方法。……   
[关键词]:hIGF-1;可溶表达;大肠杆菌Rosetta-gami(DE3);无细胞蛋白合成系统;分子伴侣
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2011年