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鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)胶体金免疫层析试纸条的研制

宋佳蕾

  鱼类淋巴囊肿病(Lymphocystis disease, LCD)是一种典型的皮肤和浅表组织慢性病毒性疾病,其呈世界性分布,可感染已知至少42科140种以上的海水、半咸水和淡水鱼类,是对鱼类危害较为严重的病毒病之一。鱼类淋巴囊肿病病原为淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)。目前LCDV的检测方法主要是组织病理技术、电镜技术、细胞培养技术、免疫检测技术和分子检测技术等。这些检测方法在准确性、灵敏性、安全性和花费等方面有各自的优点,但是它们不同程度上受到需要专业人员和复杂仪器的限制。胶体金免疫层析技术具有快速、简便、结果直观等特点,而单克隆抗体技术具有良好的特异性和灵敏度,本论文将两者结合旨在建立克服上述局限性的鱼类LCDV胶体金免疫层析试纸条。 将3株分泌小鼠抗LCDV囊膜蛋白单克隆抗体(单抗)的杂交瘤细胞株1B2、1D7和2D11扩大培养,并腹腔注射BALB/c小鼠制备抗LCDV腹水单抗。利用辛酸-硫酸铵法纯化腹水单抗,纯化后的单抗经SDS-PAGE分析,IgG重链和轻链区带明显,蛋白纯度较高,适合检测和胶体金的标记;Western blotting分析抗LCDV单抗的抗体类型,3株单抗均属于IgG类;免疫荧光实验和斑点免疫印迹实验表明3株单抗特异性地与LCDV结合;间接ELISA实验测得腹水单抗1B2、1D7和2D11的效价分别为:1:25 600、1:12 800和1:25 600;相加ELISA实验进行抗原表位分析,结果显示3株单抗识别不同的抗原表位。通过分析测定单抗的抗体类型、特异性、效价和抗原表位,选择抗体类型是IgG类、特异性好、效价较高、识别不同抗原表位的单抗1B2和2D11分别用作捕获抗体和标记抗体。 采用双抗体夹心原理制备鱼类LCDV胶体金免疫层析试纸条。以微波炉作为加热容器,利用柠檬酸钠还原法制备了粒径大小约为20 nm的单分散系胶体金。肉眼观察制备的胶体金呈红色,紫外可见光谱分析和透射电镜观察胶体金颗粒分布均匀、大小一致。通过探索胶体金与单抗2D11的最佳标记条件,确定胶体金与单抗的标记pH值为8.2,稳定胶体金的单抗标记用量为18μg/ml。以最佳标记pH值和最佳标记蛋白量对胶体金进行单抗标记,紫外可见光谱分析和透射电镜观察金标抗体,证明胶体金吸附上单抗,经免疫渗滤法鉴定,制备的金标抗体具有良好免疫活性。将金标抗体喷涂于玻璃纤维膜上制成金标垫,单抗1B2和羊抗小鼠IgG分别包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线和质控线制成NC膜检测层,与样品垫、吸收垫和塑料底板组装成鱼类LCDV胶体金免疫层析试纸条。对其进行了优化实验,筛选出合适的鱼类LCDV胶体金免疫层析试纸条制作材料。确定了金标抗体的最适稀释倍数为1:2,单抗1B2和羊抗小鼠IgG的最适包被浓度分别为1 mg/ml和0.5 mg/ml。 用鱼类LCDV胶体金免疫层析试纸条检测样品,若待测样品中含有LCDV,NC膜上检测线和质控线显示肉眼可见的红线,若待测样品中无LCDV则只在质控线出现红线,整个反应过程可在10 min内完成。鱼类LCDV胶体金免疫层析试纸条对FG细胞上滴度是1.65×2~9 TCID_(50)/ml的LCDV提取液进行检测,可以检出的LCDV量为1.69 TCID_(50)/ml。鱼类LCDV胶体金免疫层析试纸条与斑点免疫印迹法、ELISA进行比较,检测灵敏度一致。本论文研制的鱼类LCDV胶体金免疫层析试纸条具有快速、简便、准确、结果直观的特点,为鱼类LCDV的快速检测提供了一种实用的方法。……   
[关键词]:淋巴囊肿病毒(LCDV);单克隆抗体;胶体金;免疫层析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2011年