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猪硒蛋白基因TrxR2和SelH的克隆、表达及抗体制备

吴丕宏

  硒是生命活动中不可缺少的微量元素,在生物的多种生理功能中起关键性作用。硒主要是以硒蛋白的形式发挥生理功能的。目前为止,研究发现的猪硒蛋白至少有25种,但是其中大部分硒蛋白的生理功能还未确定。本研究的TrxR2和SelH在猪体中尚未有明确的基因序列的报道,所以本研究希望通过生物信息学手段克隆到猪体TrxR2和SelH基因序列,并在此基础上制备兔抗多克隆抗体,为研究硒蛋白的生理功能和作用机理提供帮助。 本实验根据NCBI GenBank中相关基因的EST序列设计引物,通过RT-PCR法从新鲜的猪肺组织中克隆了硒蛋白TrxR2和SelH基因的cDNA序列(GenBank:GU181287/GenBank:HM018602),包括完整的信号肽序列与包含硒代半胱氨酸的SECIS茎环结构。通过序列比对分析,猪TrxR2基因同人、牛、狗、猴子与猩猩等的TrxR2基因的同源性达到了85%以上,猪SelH基因同人、马、猴、狗与猩猩等的SelH基因同源性达到了93%~95%。将硒蛋白基因连接到原核表达载体pET-30a(+)上,得到重组质粒pET-30a(+)-TrxR2与pET-30a(+)-T-SelH,经CaCl2法转入表达菌BL21(DE3)pLysS,加入IPTG诱导3个小时,成功实现了硒蛋白的原核表达,使用镍亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经SDS-PAGE凝胶电泳检测,确定纯化蛋白大小约为67 KD与23 KD,与预期目的蛋白产物大小相符。并以此为免疫原成功制备了兔抗猪多克隆抗体,经过ELISA效价分析与Western blotting检测证明抗体属阳性,特异性良好。使用抗体血清通过ELISA法检测猪体各组织的蛋白提取物,得出结论:猪体中TrxR2在下丘脑中含量最高,肺中含量次之,其余组织中含量差异不显著;猪体中SelH蛋白在甲状腺中含量最高,骨骼肌与肺中含量次之。 本研究通过抗体的制备,为进一步研究硒蛋白的功能、分布及建立较简便的ELISA效价分析与Western blotting检测方法打下了基础,为纯化天然的猪硒蛋白TrxR2和猪SelH提供了技术支持。……   
[关键词]:TrxR2;SelH;基因克隆;基因表达;抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2011年