手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

一粒系小麦Pina基因与小麦生防细菌荧光假单胞菌研究

陈庆

  小麦适应性强,分布广,用途多,是世界上最重要的粮食作物,其总面积、总产量及总贸易额均居粮食作物第一位,是全世界1/3以上人口的主要食粮。在我国,小麦的地位仅次于水稻。小麦的品质和抗病性是小麦研究的重点领域。本实验主要研究了影响一粒系小麦籽粒硬度的Pina基因和拮抗小麦真菌病害的生防细菌荧光假单胞菌,主要研究结果如下: 1.以一粒系小麦为载体,采用PCR方法分离克隆一粒系小麦籽粒硬度蛋白Puroindoline a基因。得到了56份一粒系小麦影响籽粒硬度的Pina基因序列,并进行了单核苷酸多态性(SNP)分析和单倍型分析。在获得的1595 bp核苷酸序列中,有1270个保守位点,21个SNP位点和16个插入缺失(Indels)。分析得到14种单倍型,其发生频率由1到18不等。在野生一粒、栽培一粒和乌拉尔图小麦中,分别有9、8和2种单倍型。系统发育分析发现来自不同染色体组来源(Am and Au)的Pina能通过开放阅读框分析清楚地区分开来,这些研究为进一步研究一粒系小麦Pina基因功能和利用打好了基础。 2.针对小麦真菌病害(全蚀病、立枯病、赤霉病)的生物防治细菌筛选鉴定试验,以分离自加拿大渥太华地区5个试验点土样的约300株荧光假单胞菌为研究对象,运用分子生物学技术,系统的研究荧光假单胞菌的遗传多样性。 3.针对其中一土样分离得到的143株假单胞菌株中可分为两种表型群体FormⅠ和Ⅱ。运用电子显微镜和BOX-PCR、ERIC-PCR和新的Miniprimer-PCR技术以及16S rRNA和gacA基因序列测序,系统研究分离菌株不同表型和基因型的特性。基因组指纹图谱BOX-和ERIC-PCR的结果相近而不完全相同。与预期结果一致,新的图谱分析方法Miniprimer-PCR与BOX-和ERIC-PCR的相似性则较低,因其是基于16S rRNA序列设计的引物。16S rRNA基因测序及系统进化分析将菌株聚为3个主要类群,包括荧光假单胞菌(P. fluorescens)、韩国丛毛假单胞菌(P.koreensis)和恶臭假单胞菌(P.putida)。gacA基因序列聚类分析图与16S rRNA序列聚类分析图具有拓扑一致性,结果相互支持。Tajima s D统计分析发现FormⅠ菌群间有低频率的多态性,说明发生了群落膨胀或正向选择,这与16S rRNABLAST结果发现FormⅠ菌株遗传差异大相吻合。不同研究方法的结果均显示可能存在一种新的假单胞菌基因型。聚类分析也发现在加拿大农业土壤中可能存在新近确定的,只在韩国土壤环境中发现的韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis),这证明该种群具有更广泛的地理分布性。 4.通过对143株分离菌进行平板拮抗反应,筛选得到12株对三种小麦真菌病害的病原菌具有抑制作用的潜在生防菌株。实验对筛选获得的生防菌株设计了充足的鉴定试验,将分离所得拮抗菌株与已知并深入研究的生防细菌Pf-5,从生化与分子生物学各方面进行比较。通过Biolog phenotype microarrays和API 20NE试剂盒,并送公司检测磷酸脂肪酸图谱(FAME),以及运用gacA基因和16S rRNA基因全长序列,通过系统进化树分析,对生防菌株的分子生物学和生物化学多样性进行了详尽的描述。拮抗细菌的生物化学试验结果相似,除了一些小分歧以外,显示其与Pf-5菌株具有接近的表型关系,这与gacA基因序列分析结果一致。实验结果证明,BIOLOG PM板、API 20NE试剂盒和脂肪酸甲酯分析(FAME)更适用于研究菌株生化特性,而16S rRNA基因全长序列系统进化在鉴定新分离菌株种属方面更具有优势。……   
[关键词]:单核苷酸多态性位点;单倍型;BOX-;ERIC-;Miniprimer PCR;16S rRNA;gacA基因;分子系统进行分析;API 20NE;Biolog PM;FAME
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川农业大学2011年