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天府肉鹅IFN-α基因克隆表达及抗病毒活性的研究

高丽芹

  此文对天府肉鹅IFN-a (TFGoIFN-a)基因(GenBank登录号HQ115583)开展了以下系列研究:TFGoIFN-a基因克隆、TFGoIFN-a原核表达、重组蛋白复性、复性蛋白抗病毒活性的研究。 1.TFGoIFN-a基因克隆及生物信息学分析CoA诱导培养天府肉鹅外周血单核细胞,提取RNA,经过RT-PCR扩增得到天府肉鹅IFN-a基因片段,大小为648bp,构建pMD19-TFGoIFN-a克隆载体并测序。TFGoIFN-a基因含有一个576bp的ORF,191个氨基酸组成,分子量大小大约为21kDa,并且信号肽为前28个氨基酸组成,信号肽与成熟肽的切割位点在第28与29个氨基酸之间。 TFGoIFN-a是一个多G或C结尾密码子的基因,C3s(密码子第三位为C)的密码子占81.29%,偏爱程度很高。密码子偏爱性特征分析鹅IFN-a基因与鸭IFN-a基因偏爱特征相似,与鸡IFN-a基因有所不同。TFGoIFN-a基因密码子偏爱程度与E.coli,酵母以及人类总密码子偏爱程度的比值比较,差值较大的E. Coli系统有47个,Yeast系统有46个,Human系统有45个。 2.TFGoIFN-a表达载体的表达根据信号肽位置设计一对引物,扩增成熟肽TFGoIFN-a片段,构建PMD19-mTFGoIFN-a,并送公司测序,将测序正确的pMD19-mTFGoIFN-a载体与pET-32a(+)双酶切构建表达载体pET-32-mTFGoIFN-α,转化大肠杆菌Rosetta (DE3),采用IPTG诱导表达得到大小为38kDa的重组蛋白,主要以包涵体的形式存在,表达量较大,大约为6mg/mL。 3.重组表达蛋白TFGoIFN-a复性及其抗病毒活性的检测TFGoIFN-a重组蛋白通过稀释透析以及Ni-IMAC亲和层析复性后,检测到抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5X103U/mg。并且在GEF和DEF中检测到天府肉鹅IFN-a重组蛋白抗VSV效果是一致的。复性后的鹅IFN-a重组蛋白进行抗GPV, IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显著性差异(P<0.05),鹅IFN重组蛋白具有抗GPV的活性作用。在GEF中检测得到,对GPV病毒的相对抑制率高达89.4%。……   
[关键词]:天府肉鹅IFN-α;原核表达;复性;生物学活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2011年