手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

NS与PPP2R5A在HL-60白血病细胞内共定位及pCMV Myc-PPP2R5A表达载体构建

王园园

  目的: 核干细胞因子(Nucleostemin, NS)是2002年发现的维持干细胞和癌细胞增殖状态而不分化所必须的蛋白质,表达于干细胞和肿瘤细胞的核或核仁中,能与p53结合,人为控制或抑制NS的表达能改变癌细胞的病理性质。本课题先前的研究发现NS在白血病细胞系HL-60、K562及不同类型的急性白血病中均存在高表达现象,NS的信号转导方式普遍认为与p53有关,但这一理论无法解释p53缺失型白血病和实体瘤细胞的一些生物学现象。人蛋白磷酸酶2A(Protein Phosphatase 2A, PP2A)是一种丝/苏氨酸磷蛋白磷酸酶,通过可逆性磷酸化使已磷酸化激活的蛋白质脱磷酸,在信号传导承担负性调节的作用,在细胞的凋亡、增生、分化、代谢中起重要作用。PPP2R5A是PP2A的调节亚单位B的α异构体(alpha isoform of protein phosphatase 2 regulatory subunit B),决定了PP2A与底物的特异性,介导PP2A在信号转导中的作用,资料显示NS与PPP2R5A两蛋白之间存在相互作用[4],但PPP2R5A在急性白血病细胞中是否表达,及其与NS是否有相互作用,目前国内外还未见报道。该课题总的目标是探讨是否存在非p53依赖的NS信号传导途径?非p53依赖的NS信号传导途径是否与PPP2R5A蛋白和PP2A介导的信号通路有关?本课题是其子课题,旨在验证在p53缺失型细胞内是否有NS与PPP2R5A的表达和共定位,以及构建pCMV Myc-PPP2R5A表达载体,转染HL-60细胞,扩大PPP2R5A表达,为验证NS与PPP2R5A存在相互作用的co-IP奠定基础。 方法: (1) RT-PCR、免疫组化和方法检测PPP2R5A在HL-60白血病细胞系以及急性白血病患者外周血单个核细胞中的表达情况。 (2) PT-PCR方法检测NS基因和p53基因在HL-60细胞中的表达。 (3)双重免疫荧光染色法和激光光共聚焦技术观察NS和PPP2R5A两种蛋白在HL-60细胞中的共定位情况。 (4)构建pCMV Myc-PPP2R5A重组表达载体,转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆。 (5)将pCMV Myc-PPP2R5A重组表达载体转染HL-60细胞,使PPP2R5A蛋白在HL-60细胞内表达增强。 (6)数据结果用SPSS17.0统计软件处理,对定量资料,统计学均数用均数±标准差(x±SD)表示;对定性资料采用χ2检验;多样本均数比较采用方差分析,方差不齐时进行变量变换。显著性检验水准为α=0.05。 结果: (1) PPP2R5A在白血病细胞中的表达:RT-PCR、免疫组化和Western blot结果显示PPP2R5A在白血病细胞系HL-60和急性白血病患者(M5、M2、M3、ALL、混合性白血病)的外周血单个核细胞中呈表达状态,且在各类急性白血病中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。 (2)p53基因在HL-60细胞中的表达:PT-PCR结果显示p53基因在HL-60细胞中不表达。 (3)NS和PPP2R5A两种蛋白在HL-60细胞中的共定位情况:激光共聚焦结果显示NS和PPP2R5A两种蛋白在HL-60细胞胞浆和胞核中均有表达,其中NS蛋白以核仁表达为主,PPP2R5A蛋白以胞浆表达为主,二者存在共定位现象。 (4)载体构建及转染结果:成功构建pCMV myc-PPP2R5A载体,并转染HL-60细胞,阳性转染率为(18.5±2.4)%。 结论: (1)本实验证实PPP2R5A在白血病细胞系HL-60以及临床急性白血病细胞内表达,且HL-60细胞内存在NS和PPP2R5A两种蛋白的共定位。 (2)成功构建PPP2R5A真核表达载体,为进一步验证NS与PPP2R5A相互作用的co-IP实验奠定基础。……   
[关键词]:核干细胞因子;PPP2R5A;HL-60细胞;急性白血病;共定位;蛋白相互作用
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2011年