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鳗鲡致病菌快速诊断试剂盒的研制及流行规律调查

韩金钢

  鳗鲡是中国重要的养殖经济鱼类,自70年代末以来,很快发展成为中国出口创汇最多的单项水产品之一。目前中国大陆的主要养殖品种有日本鳗鲡、欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡。随着养殖集约化程度的提高,养殖环境日益恶化,鳗鲡病害成为困扰鳗鲡养殖业持续、健康发展的重要因素,尤其是细菌性病害,发病广、传播快、死亡率高,给鳗鲡养殖业者造成了巨大的经济损失。因此,快速的诊断疾病是有效防治的关键,但是目前对鳗鲡致病菌的快速诊断试剂盒的研究缺乏,对鳗鲡细菌病害的流行规律调查也甚少。鉴于此,本试验研制了15株主要鳗鲡致病菌免疫血清,并和实验室以往研制的20株主要鳗鲡致病菌免疫血清,制成35种快速诊断试剂盒,对鳗鲡主产区福建省不同养殖种类、不同季节、不同地区、不同规格的患病鳗鲡进行了检测,主要结果如下: 1.抗血清的制备。本试验采用静脉注射免疫法制备了15株鳗鲡致病菌的兔抗血清,并应用玻片凝集法对血清效价进行测定,结果显示:7株菌的抗血清效价达到2048,占46.7 % ;3株达到10~24,占20 %;3株达到512,占20 %;2株达到256,占13.3%。 2.抗血清交叉反应去除。采用玻片凝集法测定了每种免疫血清与其它34株鳗鲡致病菌(与血清对应的致病菌株除外)的交叉反应效价,并采用非特异性吸附沉淀法对存在交叉反应的血清进行了交叉去除,结果显示:具有明显交叉反应的血清有15种,占42.9 %;其中9种通过非特异性吸附沉淀法可完全去除,占存在交叉反应血清总数的60 %,且7种去除交叉后的血清效价没有下降,2种效价降低了1倍,去除交叉后的血清具有较高的效价和特异性;其余6种不能完全去除交叉反应的血清,在实际检测时可通过稀释血清使交叉反应不明显。 3.抗血清的检测灵敏度。采用玻片凝集法测定了35种血清的检测灵敏度,结果显示:检测灵敏度在1×10~8 cfu/mL以上的24种, 1×10~7 cfu/mL以上的9种, 1×10~6 cfu/mL以上的2种。 4.应用乳胶凝集实验方法检测鳗鲡致病菌的研究。为了提高试剂盒检测灵敏度,防止漏检,本试验在玻片凝集试验的基础上对乳胶凝集试验条件进行了探索。应用A蛋白亲和层析纯化后的抗体(S18和S31)致敏乳胶,并设计了不同偶联时间、抗体加入量、致敏时间和封闭时间的乳胶致敏效果对比试验,结果表明:碳化二亚胺(EDC)偶联3 h,加入纯化抗体量588.6μg/ml(S18); 568.7μg/ml(S31),25℃、200 r/min致敏10~ h,然后加入甘氨酸于25℃、200 r/min封闭30 min,得到的致敏乳胶抗体与对应抗原反应效价最高,达到512,抗原检测灵敏度最高,达到1×10~6 cfu/mL,且特异性强,重复性好,4℃保存4个月效价不变,室温保持1个月效价不变。乳胶凝集试验方法较直接玻片凝集法检测灵敏度高,但检测成本高于玻片凝集。 5.不同种类鳗鲡致病菌检测结果:3种养殖鳗鲡共检测到致病菌28株,共同的致病菌主要是嗜水气单胞菌,鳗弧菌主要感染欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡。11株鳗鲡致病菌分别仅在一种鳗鲡中检出,其中欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、美洲鳗鲡分别占5株、4株和2株,说明相当数量的致病菌具有种类特异性。 6.不同季节鳗鲡致病菌检测结果:3个季节共检测到28株致病菌,8株全年流行,嗜水气单胞菌是全年最主要的致病菌,但在不同季节检测到的具有血清型差异。13株致病菌在单一季节出现,包括春季7株,夏季4株,秋季2株,显示了较强的季节特异性。春季主要致病菌是酸克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌(血清Ⅲ型,B18)和温和气单胞菌;夏季主要嗜水气单胞菌(血清Ⅱ,B15)和鳗弧菌;秋季以嗜水气单胞菌(血清Ⅷ型,B31)为主。 7.不同地区鳗鲡致病菌检测结果:检测到28株鳗鲡致病菌,其中嗜水气单胞菌(不同血清型)分布范围广,在4个地区均出现,鲁氏耶尔森菌和霍利斯弧菌只在闽南出现,迟钝爱德华氏菌和溶解阴沟肠杆菌流行于闽西;10~株在2个不同地方同时检出;9株致病菌菌仅在单一地区出现,说明部分鳗鲡致病菌具有地域差异。 8.不同规格鳗鲡致病菌检测结果:从5个规格共检测到28株鳗鲡致病菌,其中8株在所有规格都能检出,共同的主要致病菌为不同血清型的嗜水气单胞菌、鳗弧菌和威隆气单胞菌温和生物变种;7株在单一规格检测到的致病菌中有5株出现在10~g以下的鳗鲡,它们是鲁氏耶尔森菌、霍利斯弧菌、腐败希瓦菌、1株非发酵菌和1株未鉴定结果的菌(B34),鳗弧菌主要危害10~-50g的鳗鲡,50g以上的鳗鲡以感染嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌为主,溶解阴沟肠杆菌唯一在200g以上的鳗鲡中检出。说明一些致病菌具有种类差异。 本研究结果表明:静脉注射鳗鲡致病菌免疫新西兰大白兔可以制备高效价的免疫血清,而非特异性吸附法能够对大多数存在交叉反应的血清进行交叉去除,去除交叉后的免疫血清诊断试剂盒特异性高,检测快速、操作简便,可以在现场对鳗鲡致病菌进行准确检测。不同血清型的嗜水气单胞菌是三种主要养殖鳗鲡的主要致病菌,本研究结果初步揭示了养殖鳗鲡的主要致病菌具有一定的种类、季节、地区和规格的特异性。……   
[关键词]:鳗鲡;致病菌;免疫抗血清;疾病流行规律
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:集美大学2011年