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嗜水气单胞菌成膜相关基因鉴定及其功能研究

毛秀秀

  细菌常以生物膜的状态存在于自然界,即附着在物体表面并有胞外多聚物包裹的微生物群体。近年,许多研究表明绝大多数细菌具有形成生物膜的能力。与浮游细菌相比,细菌形成生物膜后不仅具有浮游的菌体细胞本身所有的毒力特性,还可抵御宿主免疫系统和抗菌药物的杀伤作用,从而产生对抗菌药物比浮游菌高达1000倍的高度耐药性,导致感染难以清除,给人类的生产生活带来了严重危害,因此研究病原菌生物膜已成为热点主题。 应用改良的微孔板法研究了致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11的生物膜形成特性。结果表明,嗜水气单胞菌B11能在聚苯乙烯酶标板表面形成稳定而明显的生物膜;其生物膜的形成能力受温度、酸碱度、起始菌液浓度、钙、镁离子浓度等因素的影响;肌肉组织提取液也存在能影响生物膜形成的成分。本研究在上述结果的基础上,采用转座子标签技术,即通过转座子(mini-Tn10)随机插入突变构建了嗜水气单胞菌B11突变库,从中筛选到2株成膜缺陷稳定的突变菌株B188和B212。为了确证突变性状是单位点突变,根据标签序列设计两对引物,其中一对用于PCR鉴定,另一对用于扩增Southern杂交所需要的特异探针。鉴定结果显示,变株为转座子单位点插入引起的突变。再采用热不对称PCR(包括Tail-PCR和Actail-PCR)扩增转座子插入位点侧翼基因序列。扩增序列的测序结果在基因库中进行同源比对结果显示,突变菌株B188中突变基因与GenBank中已知嗜水气单胞菌A.hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966的细胞色素c4(Cyt c4)基因同源性为92%;与杀鲑气单胞菌A.salmonicida subsp. salmonicida A449的细胞色素c4(Cyt c4)基因同源性为88%,可以确认B188突变菌株中的突变基因为细胞色素c4(Cyt c4)基因;突变菌株B212部分序列比对结果显示,该序列与嗜水气单胞菌A.hydrophila ATCC 7966的菌毛合成相关基因(MshQ)的同源性为90%,与杀鲑气单胞菌A.salmonicida subsp. salmonicida A449的菌毛合成相关基因(MshQ)的同源性为88%,上述分析结果显示,该突变基因为菌毛合成相关基因(MshQ)。 最后研究了突变株在生长、早期黏附及吞噬细胞内存活能力等方面的生物学特性。结果发现,与野生型菌株相比,B188突变株在生长、粘附及胞内存活能力均明显降低;B212突变株在生长性能上与野生型菌株没有显著差异,粘附能力和胞内存活能力也明显低于野生型菌株。 研究表明,病原性嗜水气单胞菌B11可形成明显的生物膜,Cyt c4基因和MshQ基因均与其生物膜形成相关,这两个基因突变后该菌的生长、粘附及胞内存活等方面的生物学特性发生了不同程度的改变,而这些生物学特性与该菌致病性密切相关,说明形成生物膜可能也是嗜水气单胞菌的毒力因子之一。……   
[关键词]:嗜水气单胞菌;生物膜;转座子;mini-Tn10
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:集美大学2011年