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Bacillus sp. SK13.002产环糊精葡萄糖基转移酶及其催化芦丁糖基化反应的研究

孙涛

  利用环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)产生菌快速筛选法结合芦丁转糖基酶反应,从淀粉厂厂区土壤样品中分离、筛选出一株CGTase产生菌SK13.002;该菌株产生的CGTase具有较高的芦丁转葡萄糖基活性,可以高效进行芦丁糖基化。对筛选获得的菌株进行鉴定,鉴定内容主要包括细菌形态学、生理生化特性和16S rDNA序列测定。 16S rDNA测序结果表明,该菌株的16S rDNA共1476 bp;将序列到GenBank和RDP-II数据库中进行比对分析,结果发现,该序列与Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535的16S rDNA序列同源性最高,为98.5%;此外与Bacillus vallismortis DSM11031的同源性为97.5%。根据获得的16S rDNA序列,利用相关的10个芽孢杆菌的16S rDNA序列,通过软件MEGA(V4.0)构建了SK13.002的系统进化树。将SK13.002的16S rDNA序列提交GenBank,得到的接受号为GU570959。 形态学、生理生化特性鉴定结果显示,该菌株为杆状的革兰氏阳性菌,可产生芽孢,可水解淀粉,还原硝酸盐为亚硝酸盐等;结合16S rDNA序列分析结果,确定该菌株为芽孢杆菌,命名为Bacillus sp. SK13.002。 对Bacillus sp. SK13.002发酵产酶的培养基组成和发酵条件进行了优化。结果显示,最适培养基组分和产酶培养条件如下:以可溶性淀粉为碳源,浓度为1.79%;大豆蛋白胨为氮源,浓度为1.01%;酵母浸膏,浓度为0.55%;K2HPO4·12H2O 0.1%, MgSO4·7H2O 0.02%,Na2CO3 0.8%。初始pH 9.9,种龄为16 h,装液量为30~40 mL/250 mL摇瓶,接种量为3%(V/V),培养温度为37°C、摇床转速200 r/min,培养时间为96 h。 对Bacillus sp. SK13.002发酵所产CGTase进行分离纯化和酶学性质的研究,通过超滤、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析等一系列分离纯化手段,将CGTase纯化至电泳纯。实验结果显示,Bacillus sp. SK13.002 CGTase由两个同工酶(命名为CGTase-1和CGTase-2)组成。利用SDS-PAGE和LC-MS对酶的纯度和分子量进行检测,结果显示,CGTase-1和CGTase-2分子量分别为67.6 kDa和47.3 kDa。通过纯化CGTase的比酶活从粗酶的0.49 U/mg提高到9.47 U/mg(CGTase-1)和8.83 U/mg(CGTase-2),纯化倍数为37.3 ,得率为19.1%。 CGTase-1和CGTase-2水解淀粉的最适温度分别为65 oC和60 oC。二者都具有较高的热稳定性,在60°C下保温2 h,都可以保留近80%的酶活;在65°C下保温2 h,CGTase-1和CGTase-2仍分别能保留42.1%和57.1%的酶活。CGTase-1和CGTase-2水解淀粉的最适pH分别为8.0和6.5。CGTase-1和CGTase-2在非常广泛的pH范围内都能起催化作用:在pH 6.0~10.0的范围内酶活都是在最适pH条件下酶活的93%以上。CGTase-1和CGTase-2的pH稳定性极高,在pH 3.0的条件下保存2 h,酶活保留分别为96.3%和85.2%;在pH 11.0的条件下保存2 h,酶活保留分别为95.4%和93.1%;在pH4~10的环境下保存2 h,酶活保留都在96%以上。 研究了金属离子对CGTase酶活的影响,结果显示:Ca ~(2+)能略微增强CGTase-2的酶活;Fe~(3+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)则分别对酶产生了不同程度的抑制作用,其中以Cu~(2+), Zn~(2+)的抑制作用最为强烈;Mg~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)、Na+和K+对CGTase-1和CGTase-2酶活几乎没有影响;Co~(2+)和Ni+对CGTase-2酶活影响甚微,而对CGTase-1则有一定程度的抑制作用。总之,酶学性质研究结果显示,Bacillus sp. SK13.002所产CGTase同其他微生物来源的CGTase相比有其独特的酶学性质。 芦丁为生物类黄酮类物质,具抗氧化活性,可用作天然色素、抗氧化剂,在食品、化妆品和制药工业领域有着比较广泛的用途。但是,由于芦丁的水溶性很差,在水溶液中的稳定性亦不高,从而限制了其在各领域更广泛的应用。利用Bacillus sp. SK13.002 CGTase对芦丁进行酶法糖基化,对主要的酶反应条件进行了研究,实验结果显示:在几个主要酶反应条件(温度、pH、加酶量和反应时间)中,酶反应时间的对芦丁转化率的影响最为显著。在优化后的酶反应条件下,即pH为5.5,温度35°C,加酶量为每mL反应体系20 U,反应时间24 h,芦丁的转化率达到65.7%。此外,还对酶反应进程中反应产物糖基化芦丁(G-Rutins)的组分(含有不同个数的葡萄糖单元)随反应时间的动态变化过程进行了研究和探讨。芦丁转糖基酶反应实验结果亦从另一侧面反映了Bacillus sp. SK13.002产CGTase有其独特的酶学性质和催化能力。 研究了微波辐射对芦丁糖基化反应的影响。结果表明,特定功率的微波辐射可以极大地提高芦丁糖基化反应的反应速率。具体来说,在频率为2450 MHz,功率是60 W,温度为40°C的微波辐射条件下,芦丁的转糖基反应可以在数分钟内完成;同常规芦丁转糖基酶反应(没有微波辐射)相比,微波辅助转糖基酶反应的反应速率提高数十倍。此时芦丁的转化率为65.9%,而在常规条件下要达到近似的转化率则需要反应24 h以上。因此,微波辅助酶反应技术为芦丁糖基化的实用化开辟了一条新的途径。此外,还研究对比了微波辅助芦丁转糖基酶反应同常规芦丁糖基化反应进程中产物组分的变化规律和机理。……   
[关键词]:环糊精葡萄糖基转移酶;Bacillus sp. SK13.002;发酵;分离纯化;酶学性质;芦丁;糖基化;微波;微波辅助反应(MAR)
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:江南大学2011年