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三角帆蚌细菌性瘟病病原学研究与LasB基因的克隆及表达

钟蕾

  三角帆蚌瘟病是我国淡水贝类养殖和育珠生产中毁灭性病害,其传染快、死亡率高,危害严重。该病主要危害2龄以上已植片三角帆蚌,发病初期病蚌分泌大量粘液,此后对外界刺激反应迟钝,闭壳肌收缩无力,斧足紧缩不伸展,剖检观察可见消化腺由墨绿色变为黄褐色,胃肠道壁轻度肿胀,性腺颜色变浅呈糜烂状。关于三角帆蚌瘟病的病原一直存在细菌与病毒两种说法,因此,至今未能在该病的致病机理和防治上取得较大突破。为了探明三角帆蚌瘟病的病原、阐明其致病机理,以及寻求有效防治该病的方法,本研究从三角帆蚌瘟病病原细菌的分离培养入手,较系统研究了细菌的致病性、生物学特性、显微超微结构、生理生化及分子鉴定、药敏试验、主要致病菌毒力基因克隆与原核表达等,取得了如下结果。 1三角帆蚌细菌性瘟病病原菌的致病性测定 从患病三角帆蚌的病灶处分离获得15个菌株,从中选取3个优势菌株进行人工感染试验,结果表明:SJ-1、SJ-2、SJ-3菌株单独感染和混和菌感染均能引起三角帆蚌细菌性瘟病相同症状,其中混合菌攻毒后表现为急性发病,感染总死亡率达96%,SJ-1菌株感染总死亡率达68%,SJ-2菌株感染总死亡率达46%,SJ-3菌株感染总死亡率达34%。 2三角帆蚌细菌性瘟病的组织病理 组织涂片、美兰染色和显微镜观察,结果表明:SJ-1菌株主要感染三角帆蚌消化腺、鳃、性腺和斧足;SJ-2菌株主要感染三角帆蚌肠、消化腺、性腺和斧足;SJ-3菌株主要感染三角帆蚌肾脏、斧足、鳃和肠。对病变细胞超微结构进行观察与分析,发现病变细胞普遍肿大,细胞膜不完整、结构模糊甚至破裂。细胞核形状异变呈不规则状,核膜不完整。细胞质电子密度降低,细胞器分散,细胞器及内含物显著减少,线粒体、内质网、溶酶体、过氧化酶体、高尔基体、中心粒、肌原纤维等细胞器和上皮细胞游离面微绒毛的超微结构均发生了明显的病理变化。 3三角帆蚌细菌性瘟病病原菌的鉴定及药敏试验 革兰氏染色和透射电镜观察结果表明,SJ-1菌株为革兰氏阴性极生多鞭毛杆菌,SJ-2菌株为革兰氏阴性极生单鞭毛短杆菌,SJ-3菌株为革兰氏阴性,直或稍弯、两端钝圆的杆菌,有1-3根单端鞭毛。电镜观察SJ-1菌株的菌体大小为0.5~0.6μm×1.5~1.8μm左右,SJ-2菌株的菌体大小为0.5~0.6μm×1.0~1.6μm左右,SJ-3菌株的菌体大小为O.4~0.6μm×1.0~1.3μm左右。生理特征测试结果表明,SJ-1菌株的最适生长盐度为4%;最适pH生长范围为6.0~8.0;最适生长温度为25~35℃。SJ-2菌株的最适生长盐度为3%;最适pH值为7.0;最适生长温度为28-30℃,温度低于4℃和高于45℃不生长。SJ-3菌株的最适生长盐度为3%;最适pH值生长范围为6.0-7.0;最适生长温度25~30℃,4℃以下不生长,40℃起生长基本停止。16SrDNA基因进化和系统发育树分析结果显示,SJ-1菌株(GU294302)与Stenotrophomonas属的细菌自然聚类,相似性为97%,SJ-2菌株(GU294303)与Aeromonas属的细菌自然聚类,相似性达99%。SJ-3菌株(GU294304)与Pseudomonas属的细菌自然聚类,相似性均为99%。生化鉴定分析结果显示,SJ-1菌株与嗜麦芽寡养单胞菌(Senotrophomonas maltophilia)相似率为95.5%,SJ-2菌株与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)相似率为99%,SJ-3菌株与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)相似率为99.9%。综合细菌的形态特点、生理生化特性和16S rDNA基因进化和系统发育树分析,将SJ-1菌株鉴定为为嗜麦芽寡养单胞菌(Senotrophomonas maltophilia)、SJ-2菌株鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、SJ-3菌株鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 对三角帆蚌瘟病致病菌进行药敏试验,筛选出几种病原菌高度敏感的药物为丙氟哌酸、洛美沙星、左氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、加替沙星和头孢他啶/棒酸。 4.嗜麦芽寡养单胞菌弹性蛋白酶Las B基因的克隆与原核表达 克隆获得嗜麦芽寡养单胞菌弹性蛋白酶LasB基因完整开放阅读框全长序列为1497 bp,编码498个氨基酸,软件推测其编码蛋白相对分子量为53.57KDa;氨基酸序列分析表明该蛋白是含信号肽的非跨膜蛋白;氨基酸序列同源性比较表明该基因与其它菌种的蛋白酶基因家族成员同源性很高,序列高度保守;系统进化树分析表明该基因与多个菌株的蛋白酶基因亲缘关系接近。构建了嗜麦芽寡养单胞菌弹性蛋白酶基因的原核表达载体,并将重组表达载体转化至表达菌株BL21后,在原核表达系统中诱导表达出与预期结果相符的融合蛋白,为研究嗜麦芽寡养单胞菌与宿主的相互关系、致病机理及弹性蛋白酶的开发利用奠定了重要基础。……   
[关键词]:三角帆蚌;Stenotrophomonas maltophilia;Aeromonas veronii;Pseudomonas aeruginosa;致病性;病原学;组织病理;弹性蛋白酶
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖南农业大学2011年