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一株产α-半乳粮苷酶细菌的筛选、鉴定及酶基因克隆分析

周晶辉

  α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,α-D-galactoside galactohydrolase; EC 3.2.1.22)通常被称为蜜二糖酶,能特异性的水解底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。该酶在饲料工业、医疗工业、制糖工业中应用广泛。尤其当α-半乳糖苷酶作为制剂添加到以豆粕为主要原料的饲料中可以有效降解其所含的半乳糖苷类抗营养因子,减少动物肠胃疾病的发生。目前普通α-半乳糖苷酶制剂难以满足市场需求,因此有必要研发新型α-半乳糖苷酶。 多种生物都能产α-半乳糖苷酶。由于细菌来源的α-半乳糖苷酶结构相对简单,更利于通过基因工程改良酶的特性,因此本研究开展了细菌源α-半乳糖苷酶的研究。通过土壤分离,从湘西富含豆粕下脚料的土壤中筛选获得了一株产α-半乳糖苷酶的细菌,并进行了显微形态观察、革兰氏染色及16S rDNA分子生物学鉴定分析。分离菌株在显微镜下呈球状,表现为革兰氏阳性着色,其16S rDNA序列与NCBI上已登录的乳球菌属(Lactoccus)细菌序列具有98%同源性,可以将其判定为乳球菌属细菌。 采用对硝基酚方法对菌株酶活进行了测定。结果表明分离菌株产分泌型a-半乳糖苷酶,发酵粗酶液活性为6.21U/mL。该酶作用最适宜温度为45℃,最适宜pH值为5.5。细菌酶的表达活性受到D-棉籽糖的诱导而受到葡萄糖的抑制,当D-棉籽糖的浓度为30μmol/mL时诱导效果最佳,当葡萄糖浓度为30μmol/mL时酶合成有明显的抑制作用,表现出了糖代谢酶类基因表达的典型调控模式。 分离该细菌基因组DNA后,利用多切点酶Sau3A I部分酶解制备随机DNA片段,以pUC19为载体进行随机克隆并转化大肠杆菌后,针对a-半乳糖苷酶活性进行选择,成功克隆了该乳球菌编码α-半乳糖苷酶的基因(命名为agaH)生物信息学分析表明克隆片段全长为3039 bp,其中包含1230 bp的开放阅读框,编码一个409氨基酸的多肽。用Blastn程序分析表明,核苷酸水平与GenBank上己登录的序列没有高同源性序列。但其编码的氨基酸序列在10-220之间具有与糖苷水解酶2超家族(Glycosyl hydrolases 2 super family)共同保守域。说明克隆的基因是一新型α-半乳糖苷酶基因。……   
[关键词]:乳球菌;α-半乳糖苷酶;细菌鉴定;基因克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:湖南农业大学2011年