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非动物源性新型载体的研制及其对磺胺类药残检测特性的影响

陈蕾

  在免疫反应中,通常使用的动物源载体存在着安全隐患,缺陷日益明显,因此寻找一种或几种新型的安全的免疫载体便是当务之急。本论文的研究目的在于选取价格适中、结构稳定、溶解性强、在有机溶剂状态下都能和半抗原进行交联,同免疫动物的亲缘关系比较远的新型非动物源的载体。 本文选取了10种新型的非动物源的载体,与传统的动物源载体(牛血清白蛋白BSA,卵清蛋白OA)相对比,一起同磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)连接免疫兔子制备多克隆抗体,载体同SDM的偶联物也用作包被原,建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法。首次通过共振散射光谱法来表征新型抗原的结构,探究半抗原同载体的偶联比对蛋白分子微环境的改变等。通过免疫反应,筛选出免疫原性较好的载体(β淀粉酶、11S球蛋白等)和包被原性较好的载体(7S球蛋白、聚L-赖氨酸等)。 借鉴并分析了前人报道的各种半抗原合成方法,提出了新的磺胺母核结构半抗原的合成方法,合成了三种半抗原(SAS,SAS2,SAS3)。合成步骤由三步简化为两步,时间缩短为6h,提高了生物安全性,反应总产率大幅度增加。将初筛得到的大豆11S球蛋白分离纯化得到酸性亚基和碱性亚基。将合成的三种半抗原分别与七种载体相互交联(五种新型载体,BSA和OA)制得免疫原免疫兔子得到抗体,建立异源间接竞争ELISA法;分别与HRP连接制得酶标抗原,建立异源直接竞争ELISA法。将两种方法进行比较,筛选出亲和力较高的抗原载体。同直接竞争ELISA方法相比,采用间接竞争ELISA方法对十六种磺胺药物的交叉反应率和灵敏度相对较高。亲和力较高的新型抗体是SAS3-酸性亚基抗体,相应的包被原是SAS2-OA。因而,酸性亚基可以作为一种新型的免疫原载体,以期代替传统的载体。 将SAS3-酸性亚基抗体作为建立多残留检测方法的抗体,优化建立了一种灵敏度较高的板式异源间接竞争ELISA方法,此方法对溶液中十六种磺胺药物STZ、SP、SDZ、SCPA、SDMX、SMR、SMZ、SMT、SD、SME、SQ、SMD、SMX、SM、SPMX、SIZ的灵敏度(IC50)分别为1.2、1.5、2.5、3、4、5.5、8.4、12、15、17.5、20、40、60、120、150、200μg·L~(-1),最低检测限(IC15)分别为0.2、0.5、0.7、0.9、1.2、1.6、2.5、3.6、4.7、5.2、6、12、18、36、45μg·L~(-1)。通过对方法的精密度进行考察,板内变异和板间变异的变异系数均低于20%。通过试验考察了不同样品基质对ELISA方法的影响,并分别对8种磺胺药物在5种实际样品中的添加回收率进行试验,均在65-138%之间, 可以满足快速筛选方法的要求。 将磺胺间二甲氧嘧啶SDM与酸性亚基连接制备抗体,得到了一种抗磺胺间二甲氧嘧啶的新型高特异性抗体,建立了一种高灵敏度的间接竞争ELISA方法。IC50为1.22μg·L~(-1),最低检测限(IC15)为0.27μg·L~(-1)。将建立的方法应用于牛奶、猪肉、猪肝、鸡蛋及鱼肉五种样品中磺胺间二甲氧嘧啶残留的快速检测,通过试验详细考察了不同样品基质对ELISA方法的影响。分别对磺胺间二甲氧嘧啶在5种实际样品中的添加回收率进行试验,回收率在81.0-114.7%之间。 采用较为成熟的液相色谱方法进行了有效性验证,结果显示本研究所建立的间接竞争ELISA方法准确性良好,可用于上述动物源性食品中磺胺类药物的快速筛选。 进一步将所得到的族特异性较好的新型抗体SAS3-酸性亚基应用于胶体金试剂条快速检测方法的研究开发。考察了影响胶体金免疫层析试纸条性能的重要因素,对磺胺药物在实际样品中的添加回收率进行了试验,可以满足快速定性筛选方法的要求。 本论文研究确立了新型非动物源载体,并以此制备出磺胺族特异性多克隆抗体,在低MRL(最大容许残留量)水平上检测出所有磺胺类药物这一行业共性难题上有很大的突破,在磺胺类药物的多残留和单残留检测上做出了一定的贡献。……   
[关键词]:新型载体;磺胺类药物;农残检测;酶联免疫吸附分析法;酸性亚基
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华南理工大学2011年