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重楼皂甙Ⅱ对系膜细胞凋亡及细胞外基质的影响

谌南岚

  背景肾小球系膜细胞(mesangial cell-MC)增生和系膜基质增多是人类主要肾脏疾病如IgA肾病、膜增殖性肾炎、狼疮性肾炎、局灶节段性肾小球硬化、糖尿病肾小球硬化的主要病变。MC分泌细胞因子及细胞外基质,参与肾小球炎症发展过程,促进肾小球硬化。因此抑制炎症状态下MC的增殖与分泌,在增殖性肾小球疾病治疗中有重要意义。重楼主要活性成分重楼总皂甙具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤、镇静镇痛、止血、抑菌等作用。研究发现重楼皂苷Ⅱ是作用较强的免疫调节剂。目前对于重楼皂甙Ⅱ的研究主要集中在抑制肿瘤细胞增殖诱导其凋亡及免疫调节等方面,而对肾小球系膜细胞增殖、凋亡及细胞外基质尚缺乏研究。 目的研究重楼皂甙Ⅱ对异常增殖的MC及MC分泌细胞外基质(ECM)的影响及抑制MC异常增殖的作用机制。 方法常规培养MC细胞,根据乳酸脱氢酶(LDH)及细胞毒性测定结果确定重楼皂甙Ⅱ作用最佳浓度。细胞分组:(1)空白组:含10%胎牛血清的1640培养基;(2)脂多糖(LPS)组:LPS10ug/ml+含10%胎牛血清的1640培养基;(3)PPⅡ30ug/ml组:LPS10ug/ml+PPⅡ30ug/ml+10%胎牛血清的1640培养基;(4)PPⅡ40ug/ml组:LPS10ug/ml+PPⅡ40ug/ml+10%胎牛血清的1640培养基;(5) PPⅡ50ug/ml组:LPS10ug/ml+PPⅡ50ug/ml+10%胎牛血清的1640培养基;(6)雷公藤T4组:LPS10ug/ml+雷公藤T448ug/ml+10%胎牛血清的1640培养基。CCK-8法、Hoechst染色法及流式细胞技术检测PPⅡ对LPS刺激的细胞凋亡的影响。收集培养24小时后细胞总RNA及总蛋白,用Real-time PCR检测细胞Bax、Bcl-2、FN和Col-ⅣmRNA水平的表达,采用Western blot检测Bax、Bcl-2、FN和Col-Ⅳ蛋白水平的表达。 结果(1)乳酸脱氢酶(LDH)及细胞毒性测定实验显示:不同浓度PPⅡ作用24小时后,PPⅡ60ug/ml浓度组LDH较其余各组明显升高(P<0.01),有细胞毒性。遂本实验PPⅡ浓度取30ug/ml,40ug/ml, 50ug/ml。(2)LPS组各个时间点MC细胞的吸光度值高于普通培基组(P<0.01),提示LPS对MC有诱导增殖作用。不同浓度PPⅡ作用于LPS刺激的MC细胞,随着PPⅡ浓度增大,吸光度值渐趋下降。PPⅡ30ug/ml 12小时干预组与LPS组比较,吸光度值降低,但无明显差异(P>0.05)。PPⅡ30ug/ml组24及36小时与LPS组相比,吸光度值降低,差异性显著(P<0.01),提示PPⅡ对LPS刺激MC凋亡诱导有一定时效性;PPⅡ40ug/ml及PPⅡ50ug/ml组各个时间点LPS组比较,吸光度值降低,有明显差异(P<0.01),且同一时间点PPⅡ不同浓度间比较,差异性显著,提示PPⅡ对LPS刺激下MC凋亡诱导有一定量效性;雷公藤T4组与PPⅡ40ug/ml组比较,无明显差异(P>0.05),与PPⅡ50ug/ml组比较,吸光度值增高,差异性显著(P<0.01),提示雷公藤T4对LPS刺激下MC凋亡诱导作用,不及高浓度PPⅡ。(3) Hoechst染核示:空白组MC包膜完整,包核染色较深且均一。LPS组较空白组比较,细胞数增加,余无明显变化,PPⅡ组MC包膜有不同程度的皱缩,染色质聚集,荧光增强,伴不同形状的碎裂,形成凋亡小体。(4)流式细胞技术示:空白组MC凋亡率为4.23%±0.24%,LPS组MC凋亡率降低2.23%±0.23%,PPⅡ各组凋亡率明显升高。PPⅡ各组及雷公藤T4组较LPS组相比,均有显著性差异(P<0.01),表明PPⅡ及雷公藤T4均能诱导LPS刺激下的MC细胞的凋亡;而且PPⅡ各组之间两两比较,均有显著性差异(P<0.01),提示PPⅡ诱导LPS刺激下的MC细胞的凋亡有一定的量效关系;雷公藤T4组与PPⅡ40ug/ml组相比,无明显差异性(P>0.05),与PPⅡ50ug/ml组相比,明显差异性(P<0.01),提示雷公藤T4诱导LPS刺激下的MC细胞的凋亡作用弱于高浓度PPⅡ。(5) Real-time PCR及Western blot示:与空白组比较,LPS组Bax(mRNA)和蛋白、Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均上调,PPⅡ各组及雷公藤T4与LPS组比较,Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均下调,且PPⅡ各组间两两比较,均有显著性差异(P<0.05),PPⅡ各组及雷公藤T4与LPS组比较,Bax mRNA和蛋白表达量均上调,且PPⅡ各组间两两比较,均有显著性差异(P<0.05),提示PPⅡ通过上调Bax/Bcl-2水平抑制LPS诱导下MC增殖,且呈一定量效-时效关系。(6)Real-time PCR及Western blot示:与空白组相比,LPS组FN mRNA和蛋白、ColⅣmRNA和蛋白与分泌明显增加,提示LPS有诱导MC分泌ECM作用。PPⅡ各组及雷公藤T4与LPS组比较,均有显著性差异(P<0.05)。PPⅡ各组间两两比较,均有显著性差异(P<0.05),提示PPⅡ抑制LPS刺激下MC分泌ECM存在一定量效关系,雷公藤T4与PPⅡ40ug/ml组比较无显著性差异(P>0.05),与PPⅡ50ug/ml有显著性差异(P<0.01),提示雷公藤T4抑制LPS刺激下MC分泌ECM不及高浓度PPⅡ 结论 1、PPⅡ通过上调bax/bcl-2水平诱导MC凋亡 2、PPⅡ能抑制MC异常增殖,减少ECM堆积,呈一定效量-时效关系。……   
[关键词]:系膜细胞;重楼皂甙Ⅱ(PPⅡ);凋亡;bax/bcl-2;细胞外基质
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中南大学2011年