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深绿卷柏中双黄酮提取、分析及其与牛血清作用机理研究

黎霜

  深绿卷柏,药用卷柏属植物,由于良好的治疗效果,已引起许多领域的广泛关注。本文运用多种谱学技术对深绿卷柏中的双黄酮类化合物进行了一系列具有原创性的研究工作并取得以下很有意义的研究成果。 一、在单因素实验基础上,利用响应面分析法优化深绿卷柏总黄酮超声辅助提取的工艺参数,得到最佳工艺条件为:提取温度65℃,乙醇浓度70%,提取时间50min。在此条件下,提取的总黄酮含量为4.4mg/g,提取率为7.7%。以IC50值(半数抑制浓度)为次参考指标,得出了不同提取条件下提取得到的深绿卷柏粗提物抗氧化活性数据。在最优工艺条件下,IC5o值范围在20.22-46.64mg/mL之间。 二、以天然药物化学为基础,运用化学及物理分离分析方法对深绿卷柏全草的乙醇提取物进行分离、纯化,得到穗花杉双黄酮和橡胶树双黄酮2个双黄酮单体化合物以及正十八烷酸、β-谷甾醇、豆甾醇等3个单体化合物。通过核磁共振、质谱等光谱学技术确定了这些单体的化学结构。 三、运用GC-MS、HPLC-MS等现代的色谱技术,分析深绿卷柏中的各化学成分。从深绿卷柏中分析鉴定了59种化学成分。其中包括n-octacosane、9-octyl-hexacosane、3-phenyl-2-butanol等42种挥发性成分以及17种双黄酮化合物。穗花杉双黄酮、橡胶树双黄酮为深绿卷柏主要成分。采用反向HPLC法建立了同时测定穗花杉双黄酮和橡胶树双黄酮的检测方法。回收率大于95%。结果表明:所建立的检测方法适用于评价深绿卷柏药材的品质。采用HPLC法建立了深绿卷柏药材的指纹图谱检测方法,确定活性组分的分布及活性化合物的位置。依据此分离体系,考察了广西五个不同产地,15个样品的液相色谱图,得到深绿卷柏的参照液相指纹图谱。运用中药指纹图谱相似度计算软件对这些色谱峰进行评价,表明色谱图间的相关系数大于0.9。色谱图中有14个共有峰,可以确认为深绿卷柏的特征指纹峰。 四、采用负离子检测模式下的电喷雾多级串联质谱(ESI-MS)方法对穗花杉双黄酮和罗伯斯特双黄酮的质谱裂解行为进行了研究,讨论了C3 -C8 与C3 -C6 连接的双黄酮化合物结构特征与质谱裂解行为之间的异同。对卷柏属植物中其他不同连接方式的双黄酮化合物的裂解规律进行总结,得到规律性的认识: (1)双黄酮化合物在相同的质谱条件下可以在C环发生0,4健断裂,生成m/z=375的碎片离子。对于C-O-C连接的双黄酮化合物,C-O健易发生均衡碎裂,质谱图中产生较强的mm/z=271的碎片离子峰。这些离子峰为双黄酮化合物的特征离子峰。 (2)空间结构对双黄酮的裂解途径有重要影响。与C3 -C8 相比C3 -C6 和C2 -C8 连接的双黄酮更易于在离子碎片中脱去水分子出现环化的过程,生成丰度响应值较高的碎片离子m/z=519、m/z=309以及m/z=401;C3 -C3连接模式则是在离子碎片中形成内酯而出现环化的过程,产生m/z=371的碎片。C-O-C连接的双黄酮化合物中,C-O健出现非均衡碎裂产生较强m/z=285的碎片离子峰。此离子碎片中存在邻位酚羟基,更易于进一步碎裂而产生m/z为133、199、257等碎片离子。此规律可有效用于深绿卷柏中双黄酮化合物的定性鉴别,共鉴定出的17个双黄酮化合物。五、选取深绿卷柏中有代表性的芹菜素、穗花杉双黄酮、橡胶树双黄酮三个化合物分别与牛血清白蛋白作用。系统探索了在不同温度及浓度的条件下它们之间的作用机理,指出: (1)芹菜素与穗花杉双黄酮的猝灭率与浓度都遵循Stern-Volmer方程以及双对数曲线方程。但是,芹菜素对牛血清白蛋白的荧光猝灭是静态猝灭,穗花杉双黄酮对牛血清白蛋白的荧光猝灭是动态猝灭。 (2)药物分子的结构对其与血清的结合有重要影响。 A:穗花杉双黄酮与牛血清白蛋白之间的结合力比芹菜素强3-20倍,比橡胶树双黄酮强8-10倍。说明在黄酮与血清的结合过程中,羟基扮演了非常重要的作用。芹菜素与牛血清白蛋白氨基酸残基的结合距离最小,橡胶树双黄酮最大。说明在与牛血清作用的过程中,结合距离不仅与结合力有关,还与分子的体积有关。 B:在本实验条件的药物浓度下,芹菜素对牛血清白蛋白二级结构的影响大于穗花杉双黄酮。这可能与芹菜素有着更小的分子尺寸有关。……   
[关键词]:深绿卷柏;响应面分析方法;指纹图谱;质谱裂解特征;牛血清白蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中南大学2011年