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CS-PEG纳米载体介导Mcl-1 siRNA联合奥沙利铂治疗肝癌的实验研究

曾文胜

  目的: 设计与构建Mcl-1 siRNA质粒,明确Mcl-1 siRNA对肝癌细胞的治疗作用和CS-PEG纳米载体介导基因治疗的优势,通过体内外实验探讨奥沙利铂联合Mcl-1 siRNA对肝癌的协同杀伤作用,从而为临床治疗肝癌提供理论依据。 方法: 1.构建靶向Mcl-1 RNAi片段的pGCsi-H1/Neo/GFP质粒,并进行酶切鉴定和测序分析。 2.通过接枝共聚法制备壳聚糖-聚乙二醇(CS-PEG)纳米粒,用基因:纳米粒材料比1:5制备基因纳米复合物,通过其形态、粒径、ζ电位、载药量、包封率、基因保护实验考察载体的理化特性以及基因转染效果。 3.利用脂质体或CS-PEG纳米粒为载体将Mcll siRNA质粒转染入肝癌细胞中,对细胞内Mcl-1基因表达进行干扰。 4.逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测转染Mcl-1 siRNA质粒后肝癌细胞中Mcl-1 mRNA的表达,Western blot法检测转染Mcl-1 siRNA质粒后肝癌细胞中Mcl-1蛋白的表达。 5.MTT法检测Mcl-1 siRNA、奥沙利铂或联合用药对人肝癌细胞增殖抑制作用。 6.流式细胞仪分析Mcl-1 siRNA、奥沙利铂对人肝癌细胞周期和凋亡的影响。 7. Transwell侵袭实验检测Mcl-1 siRNA.奥沙利铂或联合用药对人肝癌细胞的侵袭力变化。 8.建立肝癌动物模型,用基因纳米复合物作瘤内多次注射,对比奥沙利铂腹腔注射或联合用药组,绘制肿瘤生长曲线,切取肿瘤检测体积抑制率和瘤重抑制率,免疫组化染色观察肿瘤内部的Mcl-1蛋白的分布情况,Western blot法检测肿瘤组织中Mcl-1蛋白的表达水平。 结果: 1.重组质粒经酶切鉴定与测序证实构建成功,质粒在HepG2细胞中的转染率为65.80±3.67%。转染48 h后Mcl-1 mRNA水平和蛋白水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(p<0.01), Mcl-1 mRNA的抑制率为68.2%,其蛋白水平的抑制率为71.2%。 2.空白纳米粒粒径为68.9±12.3nm,粒度分布均匀,ζ电位为32±6.4mV。在基因:纳米粒为1:5(w/w)时制备的基因纳米复合物粒径为111.4±16.9nm,ζ电位为7.5±6.4mV,包封率为86.8±9.7%,载药量为31.2±5.3%,对基因有较好的保护作用。基因纳米复合物组最大转染效率为转染后72h(81.39±3.57%),明显强于脂质体组且持续作用时间长。转染后持续作用时间较脂质体和裸基因均要长,转染72h后对Mcl-1 mRNA抑制率较两对照组明显增强。 3.MTT法检测结果显示不同的时间Mcl-1 siRNA对肝癌细胞均有抑制作用,基因纳米复合物组细胞抑制率显著高于纳米粒组和对照组(p<0.01),且与脂质体转染组相比作用时间越长(72h以上)抑制效果越明显(p<0.05)。奥沙利铂对肝癌细胞的抑制作用呈现出剂量、时间依赖性,其联合应用基因纳米复合物时对细胞的抑制作用为(71.46±6.44%),明显大于基因纳米复合物组(26.72±4.69%)和单药(20.30±2.10%)处理后的作用之和。 4.流式细胞仪(FCM)分析结果显示纳米粒对肝癌细胞周期的影响不明显,奥沙利铂作用HepG2细胞后S期细胞增加,GO/G1期细胞减少。肝癌细胞经基因纳米复合物转染+奥沙利铂处理后的凋亡率为64.21%,明显高于基因纳米复合物组(28.24%)、奥沙利铂组(21.02%)(p<0.01)。 5. Transwell侵袭实验结果显示基因纳米复合物组细胞侵过滤膜数目与CS-PEG纳米粒和对照组相比较差别明显(p<0.01)。基因纳米复合物+奥沙利铂联合作用后穿膜细胞数(53.60±16.64)明显少于对照组(176.70±12.46)、基因纳米复合物组(111.40±9.52)、奥沙利铂组(127.10±9.77)的细胞穿膜数(p<0.01)。 6.裸鼠移植瘤动物模型体内实验结果显示联合治疗组、基因纳米复合物治疗组、药物组的肿瘤体积较NC阳性对照组、阴性对照组增长明显缓慢(p<0.01)。联合治疗组、基因纳米复合物治疗组、药物组的抑瘤率分别为69.24%、53.96%、49.47%,明显高于NC阳性对照组的12.16%(p<0.01)。组织病理学检查后发现各治疗组肝癌组织以中重度坏死为主,对照组呈轻度坏死;联合治疗组、基因纳米复合物治疗组中Mcl-1蛋白阳性表达率均有所降低,表达强度较弱。Western blot检测结果显示基因纳米复合物治疗、联合治疗后对肝癌移植瘤组织中Mcl-1的蛋白表达与对照组相比有明显的抑制(p<0.01)。 结论: 1.成功构建出的靶向Mcl-1的RNA干扰质粒对肝癌细胞内的Mcl-1表达具有明显抑制作用. 2.制备出低细胞毒性的CS-PEG纳米载体,载Mcl-1 siRNA质粒后粒径约为111 nm,带正电荷,有很好的基因保护功能、较高的包封率和载药量,能高效率转染至细胞并有效抑制肝癌细胞中Mcl-1的表达,明显降低癌细胞的生存和转移侵袭能力。 3.联合应用基因纳米复合物和奥沙利铂在体外可增强肝癌细胞对奥沙利铂的敏感性,抑制肿瘤细胞生长代谢,协同作用效果大大优于单基因或单药作用的效果,能有效的降低肝癌细胞的生长和侵袭力,具有明显的临床应用价值。 4.联合应用基因纳米复合物和奥沙利铂在肝癌裸鼠移植瘤模型的体内研究中能明显抑制肿瘤组织的生长,在Mcl-1基因被沉默的情况下奥沙利铂的抑瘤作用更加明显,体积与重量明显减少,组织中癌细胞的异质性减弱,达到治疗的效果。 5.证明Mcl-1 siRNA纳米复合物和奥沙利铂联合应用对肝癌具有更好的治疗效果,为临床上对肿瘤进行生物和化学联合治疗的方案提供了理论基础。……   
[关键词]:肝癌;基因治疗;纳米载体;奥沙利铂
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中南大学2011年