手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

水产品中环丙沙星ELISA快速检测试剂盒的初步研制

杨燕燕

  本文分别采用碳二亚胺法和氯甲酸乙丁酯法制备环丙沙星的牛血清白蛋白(BSA)与卵清白蛋白(OVA)载体的人工完全抗原CPFX-BSA和CPFX-OVA。人工完全抗原经SDS-PAGE凝胶电泳初步鉴定后,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质分别为1.24 mg/mL和0.58 mg/mL,将偶联抗原稀释至一定浓度,紫外分光光度法测其波形,根据偶联前后波形及吸收峰的变化鉴定偶联物分子量大于载体蛋白,证实CPFX与BSA和OVA偶联成功,根据游离半抗原、载体蛋白和完全抗原偶联物各自的紫外吸光度、摩尔吸光系数初步定量计算出偶联结合比分别为7.2∶1和6.4∶1。质谱法测定CPFX-BSA和CPFX-OVA分子量分别为6.895×10~4和4.586×104 ,推算偶联比分别为5.6∶1和4.2∶1,进一步证实了偶联比和人工抗原制备成功。制备的完全抗原CPFX-BSA和CPFX-OVA可分别作为人工完全免疫抗原和人工完全包被抗原。 以合成的完全抗原CPFX-BSA免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CPFX-BSA的单克隆抗体,获得1株稳定分泌针对CPFX药物的单克隆抗体细胞株CPFX 5G4,腹水效价达1.28×10~(-6) ;SDS-PAGE电泳分析CPFX 5G4蛋白重链和轻链的分子量约为50 KD和25 KD;抗体亚型为IgG3;与部分喹诺酮类药物交叉反应率在8.42%~17.22%之间,与恩诺沙星的交叉反应率为62.45%,与其他常见药物不发生交叉反应。在CPFX 5G4的基础上优化CPFX检测试剂盒的间接竞争ELISA方法,建立ic-ELISA标准工作曲线,曲线方程为y = ?0.4291x+1.4802,相关指数R~2 =0.9928,IC_(50)值为192.44 ng/mL,最低检测限为16.29 ng/mL,线性检测范围在15.625~1000 ng/mL之间。分别以鳗鲡血浆、肌肉为基质进行药物添加回收试验,经检测添加回收率在60.02%~110.05%之间,平均添加回收率分别为88.74%、78.00%,基本满足ELISA免疫法测定兽药残留的要求。……   
[关键词]:环丙沙星;完全抗原;偶联;杂交瘤技术;单克隆抗体;间接竞争ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2011年