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选择性胆甾化壳聚糖衍生物纳米药物载体的研究

陈名懋

  壳聚糖作为已知天然多糖中唯一的碱性多糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性、抗菌性等优点。对壳聚糖进行疏水改性可获得具有两亲性的壳聚糖衍生物,其在水介质中可自聚集形成具有核-壳结构的纳米粒,这种纳米粒作为一种新型的药物传递系统载体受到了人们的广泛关注。 本论文选择生物内源性小分子胆甾醇为疏水基团,合成了一种新型的两亲性壳聚糖衍生物—O-胆甾醇基壳聚糖(O-CHCS),并制备了其自聚集纳米粒,评价了这种新型的自聚集纳米粒作为疏水性药物或DNA载体的可能性。主要研究工作如下: 1.以邻苯二甲酰化壳聚糖(PHCS)为中间体,将胆甾醇琥珀酸酯(CHS)选择性接枝到壳聚糖的6-OH上,再用水合肼脱去N-邻苯二甲酰亚胺基,游离出氨基,合成了选择性胆甾化的壳聚糖衍生物O-CHCS,并通过傅里叶红外光谱(FT-IR)核磁共振(1H NMR)与差式扫描量热仪(DSC)对产物进行了结构表征,研究结果证明,合成的产物是O-CHCS。采用元素分析法测定了系列O-CHCS的胆甾醇基取代度,取代度分别为1.7%、4.0%或5.9%。以芘为荧光探针考察了O-CHCS的自聚集行为及其临界胶束浓度(CMC),通过透析法制备了O-CHCS自聚集纳米粒,并利用透射电镜(TEM)和动态激光粒度分析仪(DLLS)对纳米粒的形态、粒径、粒径分布及表面电位进行了表征,研究结果表明,合成的O-CHCS是一种两亲性化合物,在水介质中能自聚集形成具有核-壳结构的纳米粒,该纳米粒呈球形,粒径为101.9-238.5 nm, Zeta电位约+25 mV,且具有较低的临界胶束浓度(0.0072-0.0175mg/mL);随着胆甾醇基取代度的增加,纳米粒的粒径和临界胶束浓度减小;通过纳米粒理化性质和材料溶解性的比较分析,优选出了制备纳米粒的最佳胆甾醇基的取代度为4.0%。 2.以抗肿瘤药物全反式维甲酸(ATRA)和阿霉素(DOX)作为模型药物,采用透析法制备了载药O-CHCS自聚集纳米粒,并考察了该载药纳米粒的理化性质和体外释放行为,研究结果表明,载药纳米粒呈球形;随着药物与载体投料比的增加,载药量增加,包封率减小;O-CHCS纳米粒对ATRA或DOX均具有一定的缓释作用。O-CHCS自聚集纳米粒及其载药纳米粒的体外细胞毒性实验结果表明,空白纳米粒在浓度为200μg/mL时仍无明显细胞毒性,而载药纳米粒对人宫颈癌细胞(HeLa细胞)的生长具有明显的抑制作用。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜研究结果表明,温育2 h HeLa细胞对游离DOX的摄取强于载药纳米粒,游离的DOX主要分布于细胞核内,而载药纳米粒则分布于细胞浆中。 3.以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,采用荧光光谱、紫外光谱及圆二色谱研究了O-CHCS内米粒对BSA构象的影响,并考察了BSA对O-CHCS纳米粒形貌、粒径、电位及体外释药特性的影响,研究结果表明,O-CHCS内米粒对BSA的构象影响并不明显;与BSA相互作用后纳米粒仍保持球形结构,粒径和电位均随着O-CHCS纳米粒浓度的增加而增大;低浓度的BSA对释放曲线影响不大,而高浓度的BSA使药物释放速率减慢。等温滴定微量热法(ITC)研究结果表明,O-CHCS纳米粒与BSA的结合是由焓驱动的放热反应。通过综合分析,推测O-CHCS内米粒与BSA的相互作用主要是由疏水作用、静电作用和氢键形成共同引起的,O-CHCS纳米粒具有良好的生物相容性,为这种新型药物载体潜在的生物毒性评价提供了依据。 4.以O-CHCS纳米粒作为基因载体,携带重组真核表达载体pCMV-hBD2转染L929细胞,对人β防御素(hBD2)在细胞中转录水平和蛋白水平的表达及体外抗菌活性进行检测,RT-PCR研究结果表明,转染pCMV-hBD2的L929细胞可有效表达hBD2 mRNA;Western blot结果验证,目的基因hBD2在蛋白水平的有效表达;抗菌活性检测结果表明,转染细胞的上清液对金黄色葡萄球菌具有杀灭作用。O-CHCS纳米粒可作为基因载体用于目的基因(hBD2)的转染,为基因转染提供了一种经济便捷的方法。 综上所述,合成的两亲性聚合物O-CHCS在水介质中可自聚集形成纳米粒,这种新型纳米粒具有良好的生物相容性,有望成为疏水性药物或DNA的理想载体。……   
[关键词]:壳聚糖;胆甾醇;邻苯二甲酰化壳聚糖;自聚集纳米粒;药物载体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京协和医学院2011年