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重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽原核表达及单克隆抗体制备

王婧

  骨形态发生蛋白(BMPs)是Urist在上世纪60年代发现,并且经过二十多年的努力最终成功制备得到的一组具有诱导骨形成活性的蛋白因子,在体内诱导新骨、软骨及与骨组织有关的结缔组织的形成。BMP-2是其中诱导骨形成能力最强的细胞因子,不仅具有原位诱骨形成作用还具有异位诱骨形成作用,同时又是一种造血调控因子,参与造血干细胞的诱导和分化。 本论文通过基因工程技术和蛋白质纯化技术获得了还原SDS-PAGE下95%以上纯度的rhBMP-2m。并建立了一套包涵体蛋白复性缓冲液高通量筛选系统,为更多包涵体蛋白能够在短时间内快速找到合适的复性和纯化方法奠定了基础。本论文的工作主要包括三部分:(1)建立包涵体蛋白复性缓冲液高通量筛选方法。该方法经过23种包涵体蛋白的验证,其中21种蛋白可以在80种复性缓冲液中至少找到一种缓冲液使其维持可溶状态,17种蛋白已经成功进行了放大试验;(2)构建原核表达系统(E.coli)表达重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m)。将构建获得的工程菌株进行5L常规发酵,收集菌体后,裂菌离心分离包涵体,包涵体变性后经阳离子交换色谱分离纯化。纯化后的变性rhBMP-2m经稀释复性,并经过反相色谱层析进行浓缩和纯化。最终,通过MC3T3-E1细胞测定其细胞生物学活性,结果显示重组表达,经复性获得的hBMP-2m具有较强的生物学活性;(3)使用第二部分所获取的rhBMP-2m免疫小鼠,获得两株稳定分泌抗rhBMP-2m抗体的杂交瘤细胞株,并成功制备rhBMP-2m的单克隆抗体,为rhBMP-2m未来的研究奠定良好的基础。 本研究的创新点在于:(1)建立包涵体蛋白复性缓冲液高通量筛选方法,并已经经过二十多种包涵体蛋白的验证;(2)改进了rhBMP-2m复性和纯化方法,获得可溶的,高纯度,高质量的rhBMP-2m;(3)首次获得rhBMP-2m单克隆抗体。……   
[关键词]:重组人BMP-2成熟肽;复性缓冲液高通量筛选;蛋白复性;单克隆抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:北京协和医学院2011年