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酶解金枪鱼碎肉制备活性肽及其分离的研究

辛建美

  金枪鱼类是世界远洋渔业重要的捕捞种类之一,金枪鱼主要是用于加工成生鱼片、鱼柳和各类金枪鱼罐头等产品,在此过程中,会产生占总重50%~70%的下脚料,大多以饲料的形式被处理,经济价值较低。我们拟运用蛋白酶酶解和超滤技术从金枪鱼碎肉中提取出具有抗氧化活性的肽类物质,为金枪鱼下脚料的综合利用提供参考。 单酶酶解是传统酶解方法,但水解率低,易产生苦味肽。我们从胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中筛选出具有较好水解效果的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成双酶体系协同水解。为了最大程度地提高双酶水解效果,在酶解前,先对原料预处理,确定最佳处理方式为:先将鱼肉匀浆与异丙醇等体积混合,于50℃下脱脂1.5h后,烘干,再设定微波萃取功率为500W,温度为50℃,对脱脂鱼肉粉微波处理10min。处理后的鱼肉蛋白水解率是未处理时的近两倍,为8.98%。影响双酶水解的因素包括双酶的添加顺序、蛋白酶添加量、酶解温度、反应体系pH和酶解时间,经单因素实验和正交试验,确定双酶同时添加的水解效果要优于分别添加,最适水解条件为;反应温度为45℃、反应时间为6h、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为15000U/g和45000U/g、体系pH7.0。在此条件下,水解度最高可达到15.83%,接近单酶水解的2倍。 酶解液中通常含有多种杂质,如未水解的碎肉、变性的蛋白酶等。超滤法是酶解液常用的分离方法。酶解液首先经过0.45μm微滤膜初滤,去除其中的杂质,再以膜通量为指标,依次采用截留分子量为10kDa和5kDa的超滤膜对酶解液进行分段分离,确定操作压力为30psi、超滤时间为10min、酶解液浓度为10%、搅拌器转速为90r/min时,可以获得较高的膜通透量。分段收集后得到三个组分:Ⅰ(>10kDa)、Ⅱ(5 kDa ~10kDa)、Ⅲ(<5kDa),得率分别为19.23%、30.71%、7.69%。酶解液主要组分的分子量分布在5 kDa ~10kDa。 活性肽抗氧化能力的比较是通过清除50%的自由基时所需的最低浓度(IC50)来衡量的。以Vc为阳性对照,依次测定组分的抗氧化能力:(1)将各组分浓度稀释至2.0000mg/mL左右,Vc浓度稀释至0.0500mg/mL左右,采用Oyaizu法测定各自还原力,按由强到弱顺序为Vc>组分Ⅲ>组分Ⅱ>组分Ⅰ。(2)将三个组分分别稀释成一系列的浓度梯度,作肽浓度关于清除率的回归曲线,结果显示:对于羟自由基(·OH),Vc与三个组分的IC_(50)分别为1.0034mg/mL、1.8923mg/mL、1.7135mg/mL、1.6419mg/mL,清除能力按由大到小的顺序为Vc>组分Ⅲ>组分Ⅱ>组分Ⅰ;对于超氧自由基(?),Vc与三个组分的IC_(50)分别为0.7361 mg/mL、2.1078mg/mL、2.0327mg/mL、1.7697mg/mL,清除能力按由大到小的顺序为Vc>组分Ⅲ>组分Ⅱ>组分Ⅰ;对于二苯代苦味酰基自由基(DPPH·),Vc与三个组分的IC_(50)分别为0.0793 mg/mL、0.7662mg/mL、0.6470mg/mL、0.6541mg/mL,清除能力按由大到小的顺序为Vc>组分Ⅱ>组分Ⅲ>组分Ⅰ。这表明,酶解液中具有较强抗氧化活性的肽的分子量集中在10kDa以下,分子量小于5kDa的活性肽的抗氧化效果最好,但与Vc相比仍有一定差距,如能进一步提高纯度,应会有很好的应用前景。 活性肽的功效评价采用氨基酸评分法(AAS)。结果显示,样品Ⅰ的氨基酸配比与参考氨基酸模式相差较大,样品Ⅱ富含赖氨酸,其他氨基酸配比与参考氨基酸模式相似,可用于制备高赖氨酸含量的产品,样品Ⅲ的蛋氨酸和苯丙氨酸匮乏,可以添加一定的蛋氨酸和苯丙氨酸,以弥补产品中两种氨基酸含量的不足。……   
[关键词]:金枪鱼碎肉;酶解;超滤;活性肽;抗氧化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江海洋学院2011年