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黄曲霉毒素M_1单克隆抗体及检测技术研究

管笛

  黄曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)是由真菌产生的一组结构类似的次生代谢产物,具有高毒性和强致癌性,已被国际癌症研究机构列为一类致癌物质。其中黄曲霉毒素M(1Aflatoxin M1,AFM1)是哺乳动物摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料后,经体内羟基化生成,并分泌到乳汁中。因此AFM1广泛存在于乳及乳制品中。随着饮食结构的调整,乳及乳制品中AFM1的存在对人类,尤其是婴幼儿的危害引起了广泛关注。世界各国设置了严格限量标准,同时也造成技术贸易壁垒(Technical Barriers to Trade, TBT)。传统的AFM1检测技术由于需要使用大量标准品和有机溶剂,不仅危害操作人员的身体健康,同时也会对环境造成二次污染,因此需要发展安全、环境友好的检测技术来保障人民消费安全。本论文主要研究方法和结论如下: 1.以AFM1-BSA为免疫原,微量抗原乳化装置乳化后免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术,半固体培养基法筛选获得一株分泌抗AFM1抗体单克隆细胞株,命名为2C9。2C9分泌的单克隆抗体(Monoclonal antibody, Mab)亲和力常数达到1.74×109 L/mol;亚型为IgG2a型;与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2均无交叉反应,为目前报道的特异性最好的AFM1单克隆抗体。高质量单克隆抗体的获得,为进一步研究AFM1免疫检测技术奠定了基础。 2.以单克隆抗体2C9为基础,研究建立了乳及婴幼儿乳制品中AFM1超灵敏间接竞争酶联免疫吸附分析技术(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。其中包被抗原AFM1-BSA的浓度为0.0625μg/mL,2C9单克隆抗体稀释度为1:10000。通过对pH值、盐离子浓度、封闭物等理化参数的优化,该检测技术对乳及乳粉中AFM1的检测限(Limit of detection, LOD)为3 ng/L,对婴幼儿乳制品中的LOD为6 ng/L。回收率范围在91~110%之间,批内和批间变异系数均小于10%。实际样品测定结果与国家标准方法测定结果相比具有良好的相关性。超灵敏AFM1检测技术的建立,为保障乳及婴幼儿乳制品的安全消费提供有力技术支撑。 3.针对ELISA检测中AFM1标准品危害操作人员健康、污染环境的问题,本研究将抗独特型抗体作为标准品替代物,应用于AFM1绿色分析技术中。胃蛋白酶法酶切抗AFM1单克隆抗体制备F(ab )2片断,经免疫新西兰大白兔,获得AFM1抗独特型抗体。该抗独特型抗体与其它黄曲霉毒素单克隆抗体以及相同亚型对照抗体均无交叉反应,只与抗AFM1单克隆抗体结合。通过在同一抑制率下浓度的比较,发现抗独特型抗体与AFM1之间存在非常好的线性关系。将抗独特型抗体作为替代标准品应用到ELISA检测当中,回收率范围在85.2~110.9%之间,批内和批间变异系数均小于10.8%。实际样品的测定结果与国家标准方法相比,相关性系数达到0.9922。 4.非标记二抗可与酶标二抗竞争结合一抗的共有位点,以非标记二抗作为竞争物应用于黄曲霉毒素ELISA反应中,研究发现该竞争曲线与黄曲霉毒素标准曲线之间线形相同,趋势一致。通过进一步研究同一抑制率下浓度的对应关系,发现非标记二抗与黄曲霉毒素之间均呈现非常好的相关性,具有稳定的函数关系。因此,提出非标记二抗作为黄曲霉毒素通用替代物的新模式。通过对识别位点、样品添加回收率的研究,证明了非标记二抗能够作为黄曲霉毒素通用替代标准品应用于ELISA检测之中。 5.以免疫亲和层析净化浓缩,ASPEC XL全自动固相萃取仪实现样品自动处理,半导体二级管激光器作为激发光源诱导荧光,建立了牛奶中AFM1快速高灵敏筛查技术。通过免疫亲和柱净化浓缩作用,激光光源提高入射光强度,大大提高了检测灵敏度,牛奶中AFM1的LOD为2.3 pg/mL,定量限(Limit of quantitation, LOQ)为24.7 pg/mL,避免了化学衍生剂的使用,缩短了检测时间,增加了检测稳定性。对50、100、500 pg/mL三个浓度的添加回收范围在87~106%之间,相对标准偏差小于8%。对25份市售牛奶样品进行了检测,结果与国家标准方法相比有很好的一致性,证明本研究方法是一种环境友好、高灵敏、快速可靠的检测技术。……   
[关键词]:黄曲霉毒素M1;单克隆抗体;酶联免疫吸附法;标准品替代物;激光诱导荧光
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2011年