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I型鸭肝炎病毒中国流行株生物学特性相关研究

刘晓丽

  鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)是引起鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)的病原,该病毒可分为3个血清型,即DHV-1、DHV-2和DHV-3,这3个血清型之间无血清学交叉反应,其中DHV-1分为A、B和C3个基因型,DHV-1在世界范围内流行和分布,是严重危害养鸭业的重要病原,造成了巨大的经济损失。 本研究以DHV-1流行病学调查为切入点,收集和采集了2003-2010年中国主要的养鸭地区,包括山东、广东、北京、福建、江苏和云南等省市110多个养殖场鸭的肝脏病料,通过接种9-11日龄SPF鸭胚,接种后72h内收集尿囊液并盲传3代以上,观察接种胚体的病理变化,结合基因鉴定等方法,分离到16株DHV-1病毒。大多数DHV-1病毒阳性病料接种鸭胚后,第一代或第二代鸭胚就会出现明显病变,表现为全身出血、发育受阻、胚死亡等病理变化,且鸭胚尿囊液对鸡外周血红细胞没有凝集活性,表明尿囊液中不含能够凝集鸡血红细胞的禽正粘病毒、副粘病毒等。 为进一步了解中国DHV-1的分子特征、基因遗传演化特征以及不同基因型病毒的分布,本研究通过对GenBank上发表的其他毒株基因组序列进行比对,在保守区设计6对引物,同时应用3′端扩增技术和RT-PCR的方法获得了这16株DHV-1病毒的全部基因组序列。结果发现,16株病毒的基因组全长在7702nt到7761nt之间。由于DHV-1病毒为小RNA病毒科中未分类病毒,因此本研究首先利用全基因组遗传发育分析将分离到的16株病毒与小RNA病毒科其它7个病毒属的14株病毒进行比较,发现本研究分离到的DHV-1与其他小RNA病毒具有较远的遗传关系,提示DHV-1应该划分为小RNA科内的一个新属。在此基础上,本研究将16株DHV-1病毒与64株DHV-1参考毒株进行了系统发育进化比较,表明DHV-1可分为A、B和C 3个基因型,与已报道结果一致。本研究分离到的16个毒株中,13个属于基因A型,另外3个为基因C型。本研究未分离到基因B型DHV-1病毒。在对DHV-1基因组序列比较分析时发现,基因C型成员基因组略长于基因A型病毒基因组,分别在VP1基因和3`UTR内有插入。同一基因型内的DHV-1病毒序列同源性在90%以上,而不同基因型病毒序列同源性不足80%。 为研究DHV-1对鸭的致病性,本研究选择基因A型病毒Du/CH/LBJ/090809作为代表毒株对雏鸭进行攻毒试验。结果显示该毒株对SPF雏鸭的致死率为30%,攻毒24h后部分雏鸭开始死亡,死亡鸭的病变部位主要集中在肝脏,表现为肝脏肿大、出血及坏死等;同时伴有脾脏和胆囊肿大等病理变化。此外,本研究通过原核表达系统获得了Du/CH/LBJ/090809病毒的7个重组蛋白以建立ELISA检测方法,通过比较筛选,发现重组的VP0和VP1-2蛋白免疫原性较好,而且具有较好的重复性,可以作为检测抗原。以此作为包被抗原,建立ELISA抗体检测方法,发现Du/CH/LBJ/090809感染后的雏鸭第8天开始发生血清阳转,12天达到高峰,32天之内抗体仍为阳性。 为了进行DHV-1的鸡胚适应,以便为疫苗研制等奠定基础,本研究通过9-11日龄鸡胚系列传代,成功将Du/CH/LBJ/090809适应鸡胚。发现第29代(P29)病毒能够稳定地在鸡胚中繁殖并致鸡胚典型病变,利用该鸡胚传代适应毒株接种雏鸭,发现其对SPF雏鸭不产生致病作用。继续传至第40代(P40)进行雏鸭的接种和亲本强毒的攻毒试验,发现该病毒不但不引起雏鸭发病,而且能对亲本强毒的攻击提供了良好的保护性。表明该毒株具有疫苗研制的良好性能。为了进一步说明鸡胚适应和致弱过程在基因组水平的体现,本研究对P16、P29和P40的基因组与其亲本毒基因组进行比较分析,结果显示,病毒在适应鸡胚过程中,病毒基因组发生了明显变化,主要表现为核苷酸的突变及其导致的氨基酸的替代,突变的主要位点位于L、VP1、2C和3D蛋白。 在以上研究基础上,本研究以弱毒株Du/CH/LBJ/090809 P40基因组为基础,进行基因点突变的分子修饰,构建了cDNA全长的感染性分子克隆,通过体外转染BHK细胞后,将细胞液在SPF鸡胚连续盲传,对传代至第4代时对鸡胚的致病性、分子Marker的鉴定均表明已成功拯救得到重组病毒粒子。这将为DHV-1的遗传进化、致病机理、基因功能等相关研究奠定基础。……   
[关键词]:I型鸭肝炎病毒;基因组;致病性;鸡胚传代;感染性克隆
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2011年