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水稻白叶枯病菌转录调控因子Clpxoo的cNMP受体和DNA结合结构域的功能初探

王红敏

  由黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)引起的水稻白叶枯病是世界上重要的水稻细菌性病害之一。Xoo在与水稻互作过程中需要一系列信号调控网络机制调控对寄主植物的侵染。然而,这些信号调控机制对细菌毒性的确切功能尚不完全清晰。研究表明,环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是广泛存在于各类细菌中的第二信使,调控细菌多方面的生物学功能。本室在解析Xoo的c-di-GMP信号途径及其功能方面已开展了一些基础性研究工作。前期研究表明,转录调控因子Clpxoo是推导的c-di-GMP信号受体蛋白,在Xoo中调控了胞外多糖产生、生物膜形成、菌体沉降、H2O2敏感性和对水稻的致病性等性状。然而,对Clpxoo的作用机理尚不明了。因此,本研究重点对Clpxoo的cNMP结合结构域和DNA结合结构域(HTH)进行了初步的功能解析,主要开展了以下工作: (1)利用表达载体pET28a(+)成功诱导表达了Clpxoo蛋白,并通过Ni~(2+)离子交换树脂进行蛋白纯化,得到了纯度较高的非变性目的蛋白。 (2)采用qRT-PCR方法,定量测定△clpxoo中调控鞭毛运动性的σ~(54)因子编码基因rpoNxoo及内聚葡糖酶编码基因engXCAxoo的转录本表明,Clpxoo正调控rpoNxoo和engXCAxoo的表达。采用生物信息学方法,预测其启动子区域可能具有Clpxoo结合的保守序列,分别在rpoNxoo和engXCAxoo距翻译起始位点上游187 bp和318 bp处,二者序列相似性分别为60%和80%。采用生物素化学发光凝胶阻滞实验(EMSA),检测Clpxoo蛋白与rpoNxoo、engXCAxoo启动子区及大肠杆菌中Crp所结合的特异寡核苷酸片段H的相互作用,结果发现Clpxoo蛋白与上述基因启动子片段无阻滞现象发生,表明Clpxoo与上述基因启动子区无结合作用,推测Clpxoo对它们起间接调控作用。 (3)通过等温滴定量热实验(ITC),对Clpxoo蛋白与c-di-GMP的反应热量进行了初步监测。初步确定Clpxoo蛋白结合c-di-GMP,两者之间有相互作用,推测Clpxoo蛋白是c-di-GMP的新受体蛋白。 (4)利用不同的表达载体,对与c-di-GMP信号途径相关基因PXO_01019、PXO_03877及PXO_04753进行了原核表达。利用pET28a(+)原核表达了PXO_01019蛋白,用pET32a(+)和pGEX-4T-1原核表达了PXO_03877及PXO_04753蛋白,为下一步对这些蛋白进行功能研究奠定了基础。 总之,本研究初步阐明了Clpxoo蛋白具有与小分子第二信使c-di-GMP结合的功能,并且调控了下游基因的表达。……   
[关键词]:cNMP结合结构域;DNA结合结构域;ITC;EMSA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2011年