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FGFR4的克隆表达及纯化工艺的研究

孔祥鑫

  成纤维细胞生长因子受体4(fibroblast growth factor receptor 4, FGFR4)是成纤维细胞生长因子受体家族中较晚被发现的一类跨膜酪氨酸激酶受体,为单链的糖蛋白,由胞外区、单次跨膜区和细胞质内的酪氨酸激酶区三部分组成,通过与成纤维细胞生长因子进行结合,启动PLC、Ras和JAK/STAT等多条信号转导通路,将细胞外信号传递到细胞内。在胚胎组织中较高表达,成人中主要表达于生长活跃的组织内并在许多肿瘤组织内过量表达和发生突变,主要参与胚胎发育、创伤愈合、血管生成、组织分化和修复等重要的生理进程。对乳腺癌、肝癌等癌症的发生、发展起着重要的作用,并成为癌症前期极好的预测因子和治疗学中有效的靶位点。 目的:从肝癌细胞中获得目的基因片段并转入大肠杆菌中进行原核表达,对表达条件进行优化并摸索出以包涵体形式表达的目的蛋白的稳定变复性条件和纯化工艺,鉴定纯化出的FGFR4蛋白并进行活性测定。 方法:从HepG2细胞中提取总RNA,以其逆转录的cDNA为模版扩增FGFR4的配体结合区片段(D2-D3),然后与pET22b载体连接并转化到克隆菌株DH5α进行重组子鉴定,鉴定正确的原核表达载体pET22b-FGFR4转入表达菌株BL21 (DE3)中。利用IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定,通过对菌液诱导时机、诱后收菌时机和IPTG浓度等条件的摸索后进行发酵罐高密度发酵,以超声破碎方式进行菌体破碎,离心后将沉淀洗涤,并以高pH值的3M尿素溶液溶解,然后用复性缓冲液缓慢的稀释和透析,至尿素含量为0.25mol/L时,过G25除去变性剂和多余的盐离子。蛋白溶液经过阴离子交换层析除去杂蛋白和DNA,过高效液相色谱对纯化后的FGFR4蛋白进行纯度测定,并用MTT法进行活性鉴定。 结果:DNA测序结果表明成功构建了高效表达的重组表达菌株BL21(DE3)/ pET22b-FGFR4。在工程菌的优化表达方面,采用37℃摇床培养至菌液浓度为A600=0.8-1.0时加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导6h以上,其目的蛋白表达量高于25%。发酵培养时收获菌液的吸光度A600可达30以上,平均每升发酵液获得62g菌泥,其目的蛋白表达量高于20%。菌体经破碎离心后,沉淀经两次洗涤得到的包涵体中目的蛋白纯度高于80%,洗涤后的包涵体经强碱性的低浓度尿素溶液溶解,此过程可以有效的保留正确折叠的FGFR4蛋白,并促进部分错配的蛋白折叠成正确的构型。在尿素含量降为0.25mol/L时,过G25除去变性剂,很好的解决了包涵体变复性时易产生絮状沉淀的问题。复性后的蛋白溶液经阴离子交换层析纯化后,经高效液相色谱仪分析,其纯度高达95%以上,细胞测活表明,纯化后的包涵体蛋白具有一定的蛋白活性,能够促进肝癌细胞的增长,因此推测肝癌细胞自身含有的FGFR4能够促进凋亡。 结论:成功构建了重组的克隆工程菌和表达工程菌,确定了较好的表达条件,高密度发酵条件和创新了胞外区蛋白的变复性条件,获得了纯度较高且具有生物活性的FGFR4配体结合区蛋白,为日后更好的开发利用FGFR4胞外区蛋白奠定实验基础。……   
[关键词]:FGFR4;包涵体;克隆;高效表达;纯化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2011年