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树舌灵芝液体深层发酵浸膏多糖的抗肿瘤活性研究

刘小腊

  树舌[Ganoderma applanatum (Pers.ex Gray.)Pat]属于担子菌门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属,中医记载树舌气微、味淡,具有清热、消积、化痰、止痛等多种功效,大量研究发现树舌多糖具有提高免疫力、抗病毒、降血糖、抗菌消炎、保肝健胃等药理活性,尤其在抗肿瘤作用方面表现出活性强,无毒副作用等优点,这为新型抗肿瘤药物的开发利用提供了合理的理论基础。 本实验以树舌灵芝液体深层发酵浸膏为材料,单因素实验分别考察温度、料液比、浸提时间、浸提次数对水提粗多糖的影响,结果在90℃、1:50液料比、浸提3h、浸提4次条件下,GAFPⅠ的糖得率最高。根据单因素实验数据设计正交试验,结果显示85℃、1:40料液比、提取3h,浸提3次为水提GAFPⅠ最佳方案。水提后的不溶性残渣,以单因素实验考察温度、NaOH浓度、料液比、提取时间对碱提多糖的影响,结果温度75℃、0.2MNaOH、1:40液料比、浸提3h时GAFPⅢ的糖得率最高。设计正交试验碱提残渣中的GAFPⅢ,结果表明,GAFPⅢ的最佳提取方案是:75℃、0.2M NaOH、1:30料液比、浸提3h。所得的多糖经sevag除蛋白,共得4种粗多糖:GAFPⅠ、GAFPⅡ、GAFPⅢ、GAFPⅣ,苯酚-硫酸法检测糖含量分别为86.14%、88.45%、13.57%、20.12%;福林酚测定蛋白质含量分别为16%、3.2%、9.69%、0.46%。将所得的多糖分别进行体外和体内抑瘤实验,以研究其抗肿瘤活性,并对相关作用机制作进一步的探讨。 体外抑瘤实验应用MTT法考察了4种多糖体外对人结肠腺癌细胞SW1116、人小细胞肺癌细胞NCI-H446、人肝癌细胞SMMC-7721、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒作用,结果显示4种多糖对肿瘤细胞均表现出一定的抑制作用,相比之下,GAFPⅠ对SW1116细胞的生长增殖呈现出明显的抑制作用(P<0.01),且抑制率与其浓度呈量效依赖性,最大抑制率达72.48%, GAFPⅠ抑瘤效果最佳。细胞形态学和荧光显微镜下观察,GAFPⅠ可使SW1116细胞呈现出凋亡早、晚期染色质的核型变化,证明GAFPⅠ具有诱导肿瘤细胞凋亡的活性。SW1116细胞PI单染后经流式细胞仪检测,结果显示GAFPⅠ可将SW1116细胞阻滞于有丝分裂G2/M期,通过抑制细胞的无限制分裂达到抗肿瘤效果。 体内抑瘤实验证明,GAFPⅠ能抑制小鼠移植性肉瘤S180细胞在体内的生长,且抑瘤率与GAFPⅠ浓度和作用时间呈依赖性关系,同时,GAFPⅠ还能提高小鼠免疫器官的胸腺指数和脾脏指数。淋转实验结果表明,GAFPⅠ能刺激小鼠淋巴细胞的增殖,促进ConA对T淋巴细胞的丝裂原作用,且增值率与药物浓度具有显著的依赖关系。另外,GAFPⅠ可增强荷瘤小鼠血清中SOD、CAT、溶菌酶的活力,降低MDA的含量,促进细胞因子(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌,提示GAFPⅠ在机体内的抗肿瘤作用可能通过提高其抗氧化作用和调节免疫系统来实现。RT-PCR结果显示,GAFPⅠ可促进Rb抑癌基因mRNA在免疫器官内的表达水平,从分子生物学角度证明GAFPⅠ可通过调节癌基因和抑癌基因的表达实现其抗肿瘤作用。……   
[关键词]:GAFP;苯酚-硫酸法;MTT法;细胞周期;抑瘤率;淋转实验;ELISA;RT-PCR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2011年