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鸭疫里默氏杆菌OmpA与鸭IL-2融合基因的克隆与原核表达

刘佳丽

  鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)病是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种急、慢性传染病。本病可导致家鸭、鹅、火鸡等多种家禽及野禽出现纤维素性三包炎、脑膜炎、输卵管炎、关节炎等,其发病率和死亡率均较高,给养鸭业带来严重的经济损失。本病易与其它病原微生物混合感染,如禽大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、衣原体病、禽巴氏杆菌等。本病一旦感染较易形成地方性疾病,难彻底根除且易反复爆发。至今已报道鸭疫里默氏杆菌共有21个血清型,并且不断有新的血清型被发现。目前,药物治疗是本病防治的主要措施,但由于药物滥用现象较严重,且极易产生耐药性,并带来相关食品安全问题。因此,免疫接种已成为预防和控制本病的关键。近几年,国内外学者都致力于RA高保护性抗原的选择及亚单位疫苗制备的研究,其中RA的外膜蛋白(OmpA)是被公认为RA的高保护性抗原。 白细胞介素-2(Interleukin-2, IL-2)是辅助性T细胞和NK细胞受丝裂原或抗原刺激后产生的一种重要细胞因子,是机体免疫调节中的核心物质之一,与其它细胞因子共同完成机体免疫机能的平衡调节。IL-2不仅能刺激T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞分化、增殖和分泌抗体,而且可促进干扰素、肿瘤坏死因子等免疫调节因子的释放,增强机体的免疫功能。因此,IL-2是保障机体正常免疫功能的重要因素。IL-2具有一定的种属特异性,家禽的IL-2不能作用于人和其它哺乳动物。目前,已有应用IL-2的基因工程苗预防鸡、鹅传染病的相关报导,但关于IL-2的基因工程疫苗在鸭病中的应用的报道较少。为提高鸭疫里默氏杆菌疫苗的免疫保护力,本研究将IL-2应用于RA的OmpA基因工程疫苗中,为新型疫苗的探索和开发奠定试验基础。 本试验从疑似鸭疫里默氏感染病鸭的心血、肝脏及脑部分离出一株革兰氏阴性短杆菌。经形态特征观察、理化鉴定、病理组织学观察等,均符合里氏杆菌属鸭疫里默氏杆菌特征。菌株16S rRNA序列经BLAST比对,进行同源性分析,结果分离株JL-RA1(登录号HQ392516)与已报道的鸭疫里默氏杆菌16S rRNA序列同源性较高,达99.1%-99.9%,其中JL-RA1与RA标准株ATCC11845(登录号U60101)序列同源性99.6%,与RAf54(登录号EU016547)、RAD-24046(登录号EU871818)的16S rRNA序列同源性达99.9%。鸭疫里默氏杆菌株系统进化分析表明:JL-RA1与RA-YM(登录号FJ031240)、RA f75(登录号EF641572)、RA f54(登录号EU016547)及RAD-24046(登录号EU871818)的16S rRNA序列最近,与RAH-2565(登录号AY871820)较远。 设计特异性引物,扩增分离株JL-RA1 OmpA基因,并在上游引入酶切位点,下游引入一段互补linker, PCR扩增出OmpA基因,序列大小为1182bp。从健康成年鸭的外周血中分离淋巴细胞,经ConA刺激后,提取外周淋巴细胞的总RNA,设计特异性引物,上游引入一段互补的linker,下游引入酶切位点,RT-PCR扩增出DuIL-2成熟蛋白基因,序列大小为381bp。以OmpA的上游和DuIL-2的下游为一对引物,经SOE-PCR,成功扩增OmpA-DuIL-2融合基因,该序列大小为1551bp。将融合基因转入大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建pET-OmpA-DuIL-2融合表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta (DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析得到分子量大小约为61kDa的融合蛋白,经Western-Blot分析该融合基因同时具有两者的反应原性。……   
[关键词]:鸭疫里默氏杆菌;OmpA基因;DuIL-2成熟蛋白基因;融合基因;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2011年