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雪卡毒素单克隆抗体的制备及鉴定

张彩霞

  雪卡毒素是一种来源于冈比尔盘藻并通过食物链在珊瑚鱼体内富集的毒素。全世界每年约50000人遭受雪卡毒素中毒的困扰,因而建立一种快速有效的检测方法成为科学家共同关注的课题。本论文利用雪卡毒素结构类似物莫能菌素为半抗原,合成雪卡毒素人工抗原并免疫小鼠,制备杂交瘤诱导腹水并获得高效价高特异性的单克隆抗体,建立雪卡毒素的免疫分析方法。 分别采用混合酸酐法和碳二亚胺法(EDC)将莫能菌素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和鸡血清蛋白(OVA)偶联,合成莫能菌素人工免疫抗原和包被抗原。以免疫抗原免疫Balb/c小鼠3次后测定血清抗体效价及特异性。取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合制备杂交瘤,依据效价和特异性高的原则筛选并进行4次有限稀释亚克隆筛选,建立稳定的细胞株。通过体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,收集腹水并采用辛酸硫酸铵沉淀法进行纯化,SDS-PAGE和紫外分光光度法鉴定抗体纯度和含量。建立雪卡毒素间接竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,并鉴定雪卡毒素单克隆抗体的特异性。 实验结果:(1)经TLC及SDS-PAGE鉴定成功合成了雪卡毒素的人工免疫抗原及包被抗原,其中莫能菌素分子与BSA和OVA的偶联比分别为18.5:1和7:1。(2)获得3株稳定分泌抗雪卡毒素抗体的杂交瘤细胞株1D5、2G11、3G11,且3株细胞分泌的抗体均属于IgG1亚型,轻链为K链。(3)腹水抗体纯化后经SDS-PAGE鉴定有两条带,一条为重链,约55KD,另一条为轻链,约28KD。获得较纯的腹水单抗,其蛋白含量约为4.127mg/mL。(4)建立的雪卡毒素间接竞争ELISA条件为:包被抗原5μg/mL,37℃包被2h;3%脱脂奶粉封闭1h;一抗稀释倍数1:6400;甲醇浓度10%;板外竞争;二抗工作浓度1:10000;显色15min。(5)建立的雪卡毒素间接竞争ELISA标准曲线方程为y=10.722x+25.399,线性相关系数R2=0.9939,最低检测限为0.12ng/mL。检测范围为0.12ng/mL~15.6ng/mL。(6)特异性实验测定了雪卡毒素单抗与其结构类似物莫能菌素、海南霉素、马杜霉素的交叉反应,结果表明制备的抗体与海南霉素及马杜霉素的交叉反应率均小0.01%,与莫能菌素的交叉反应率较高。 结论:本研究制备的雪卡毒素单克隆抗体,特异性相对较高,为雪卡毒素免疫分析方法的进一步研究奠定了基础。……   
[关键词]:雪卡毒素;酶联免疫分析方法;莫能菌素;单克隆抗体;间接竞争ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:广东工业大学2011年