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无载体无选择标记转基因耐贮藏甜瓜的培育

郝金凤

  甜瓜是世界上十大水果之一,河套蜜瓜是内蒙古西部河套地区特产的地方优良甜瓜品种,是本地区主要的经济作物之一。其果实是典型的呼吸跃变型果实,成熟后迅速软化腐烂,严重制约河套蜜瓜生产的发展。 本论文以河套蜜瓜成熟果实的RNA为模板,应用RT-PCR技术分别克隆得到ACC合成酶1(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase, ACS1)、ACC氧化酶1(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO1)、乙烯受体ETR2和3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)基因的全长cDNA序列,序列分析表明,各基因cDNA长分别为:ACS1 1531bp,编码493个氨基酸;ACO1 1035bp,编码318个氨基酸;ETR2 2304bp,编码767个氨基酸;HMGR 1939bp,编码588个氨基酸。与已报道的甜瓜各基因cDNA的序列同源性很高,所编码的蛋白质序列完全一致。 应用实时荧光定量RT-PCR技术对不同发育阶段的甜瓜果实中各基因的表达特性进行了分析。结果表明,ACS1和ACO1基因的表达从授粉后第30天(day after pollination, DAP)起表达量开始增加,40DAP表达量迅速跃变达到最大,之后下降,与15DAP相比,两者分别增加了60倍和30万倍的表达量。ETR2基因在15DAP至30DAP表达没有变化,35DAP表达量开始上升,上升趋势一直持续至45DAP,最高表达量为15DAP的9倍。HMGR基因的表达在25DAP有一个峰值,表达量为15DAP的3倍,之后下降,在35DAP表达量又开始回升,到40DAP达到最大值后开始下降,最高表达量为15DAP的16倍。 以植物双元表达载体pPZP221(GenBank中登录号:U10491)为构建的初始载体,用限制性内切酶Pmel和Asel双酶切去除植物抗性选择标记庆大霉素乙酰转移酶基因aacC1(Gentamycin acetyltransferase gene),并在该位点重新插入CaMV35S启动子和nos终止子序列,获得载体pPZP201(35S-nos)。分别将ACS1基因cDNA编码区的588bp和ACO1基因cDNA编码区的710bp片段反向构建到pPZP201 (35S-nos)载体,命名为pPZP201-ACS1和pPZP201-ACO1。用限制性内切酶PsyⅠ和PaeⅠ双酶切载体pPZP201-ACS1和pPZP201-ACO1,获得无载体骨架序列无选择标记基因的长约2.3kb的RB-35S-反向目的片段-nos-LB线性表达盒。 采用花粉管通道法将构建好的各基因的线性表达盒导入河套蜜瓜,获得大量转化种子。PCR检测证明外源基因已经整合到受体植物的基因组中,经表型筛选证实,已经获得了耐贮性强的T2代转反义ACS1和反义AC01基因株系。经RT-PCR检测证明反义AC01基因已经在转基因果实中表达。T2代转反义ACS1和反义AC01基因果实的乙烯含量分别为对照果实乙烯合成量的7%和5%左右,转基因果实在常温下贮藏30天时,果实硬度基本保持不变,果实不过熟、不霉变。而非转基因对照果实在12天内已经软化腐烂。对T:代转反义AC01基因甜瓜花特性的研究表明,转基因甜瓜与非转基因对照甜瓜在花粉形态、花粉萌发特性上无明显差异。转基因甜瓜两性花着生节位(第11节)高于非转基因对照甜瓜两性花着生节位(第8节)。转基因甜瓜花梗在离体条件下表现出延迟脱落的现象,与非转基因对照甜瓜相比,花梗脱落延迟约9.6小时。……   
[关键词]:甜瓜;无载体;无选择标记;花粉管通道法;ACC合成酶基因;ACC氧化酶基因
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:内蒙古大学2010年