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过表达热休克蛋白70提高CHO细胞表达抗体的能力

黄芬

  在漫长的生物进化过程中,热休克蛋白是生物体保留下来的可用于对抗外界损害并能够进行自我保护的重要机制之一。热休克蛋白是在温度升高或者其他的应激条件下(缺氧,低温或者辐射等)通过热休克基因所编码的一类在生物进化过程中最为保守的伴随细胞蛋白。热休克蛋白70的家族种类最多,一共有21种蛋白质,因此也就成为了在热休克蛋白家族中研究最多的一种,它们主要参与了蛋白质的折叠,组成相应的蛋白亚基以及降解没用的蛋白质等过程,还能够调节和稳定靶细胞的活性及功能,但它们本身却不参与目的蛋白(靶蛋白)的组成,所以热休克蛋白的重要作用是“分子伴侣”的作用。该作用主要表现在促进蛋白质的折叠、转运及组装;保护及稳定细胞结构;呈递抗原帮助细胞免疫以及肿瘤免疫等,还能够恢复和加快清除细胞内已经变性的蛋白质,能使细胞产生耐受使之更能适应环境的变化。多年来的研究发现HSP70能够抑制细胞凋亡(当然还有些研究证明了HSP70能够促进细胞的调亡),促进细胞的增殖,使生物体获得耐热性或者耐药性从而达到保护细胞的作用,因此有关研究人员分析是否可以通过增加细胞内HSP70蛋白的表达来促进细胞内分泌性蛋白即抗体的产生。 本研究是通过在中国仓鼠卵巢组织细胞中过表达HSP70以提高其表达抗体的能力。其主要技术路线为:首先是通过常规PCR从中国仓鼠卵巢组织细胞的基因组DNA中扩取出HSP70基因;然后再将所扩取的HSP70基因连接到克隆载体pEASY-B中,构建成克隆质粒pEASY-HSP70;再将此克隆质粒在大肠杆菌DH5a的感受态细胞中转化,挑取数个单克隆经过夜摇菌提质粒后进行双酶切鉴定及测序鉴定,将鉴定正确的质粒经双酶切把目的基因HSP70纯化回收后连接到真核表达载体pcDNA3.1中,构建成表达质粒pcDNA3.1-HSP70;然后通过脂质体的介导,稳定转染到CHO/dhfr细胞中;通过RT-qPCR检测HSP70基因的过表达水平;G418加压,96孔板筛选获得过表达HSP70的稳定细胞系并将其进行扩大培养后用于后续实验。在过表达HSP70的CHO/dhfr细胞组和转染空载体pcDNA3.1的CHO/dhfr-细胞组中分别转染表达抗-HBs的质粒,ELISA检测两组细胞中表达抗-HBs的能力,并且比较两组细胞表达抗-HBs的能力。目前,人们对HSP70的功能的研究已经非常全面。本研究建立了稳定的过表达HSP70的CHO/dhfr-细胞系,经研究可被用于提高目标抗体的表达量。 通过以上的实验得出下列结论:RT-qPCR结果显示转染了表达质粒pcDNA3.1-HSP70的实验组CHO/dhfr细胞的HSP70 mRNA的水平明显高于转染空载体pcDNA3.1的CHO/dhfr细胞;ELISA检测结果表明过表达HSP70的CHO细胞的抗-HBs表达量高于对照组的CHO/dhfr细胞(P<0.05)。研究表明HSP70能有效的促进细胞分泌性蛋白的表达。……   
[关键词]:HSP70;分子伴侣;CHO细胞;抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:陕西师范大学2011年