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微透析与指纹图谱联用技术在中药复方药动学研究中的应用

付湘

  1目的 中药药动学研究是在中医药理论指导下,利用动力学的原理与数学处理方法研究中药进入机体后的吸收、分布、代谢和排泄等过程的动态变化规律。目前的中药药动学研究仍主要针对单味中药或中药复方中的单体成分,但由于中药本身具有多成分、多靶点、多效应的特殊性,以单体成分的药动学行为代表整个中药是不准确也是不全面的,因此非常有必要建立一种能够准确、全面说明中药复方的药动学研究方法。 本研究以注射用双黄连(冻干)为模型药物,建立其高效液相色谱指纹图谱,探索适宜的微透析采样条件,研究内标法测定探针回收率的可行性,并运用上述研究成果对微透析与指纹图谱技术联用于中药复方药动学研究进行探索。 2方法 2.1注射用双黄连(冻干)指纹图谱的建立 运用高效液相色谱法建立双黄连色谱指纹图谱,使之适用于双黄连制剂以及血液样品的检测,同时满足微透析内标物的洗脱要求,对色谱条件进行优化并进行方法学考察。2.2微透析探针回收率的研究 分别考察了灌流液流速、温度、浓度、透析媒介所含物质数量等因素对探针回收率的影响以及回收率的稳定性;通过初步筛选并考察不同情况下内标物释放率的变化情况,筛选出合适的内标物并确定待测成分回收率与内标物释放率之间的比例P值的稳定情况。 2.3注射用双黄连(冻干)的药动学研究 通过体外血浆蛋白结合率测定验证微透析采样技术应用于药动学研究的可行性。将微透析探针植入兔耳缘静脉,兔颈动脉插管,静脉注射给药,同时使用微透析法和传统血药浓度法进行采样,采样时间为3h以上。用内标物动态监测待测成分回收率并换算出血液中的游离药物浓度,血液样品经处理后测定血浆中的药物浓度,分别绘制药时曲线,采用房室模型计算药动学参数。 3结果 3.1建立了注射用双黄连(冻干)的色谱指纹图谱 经色谱条件优化和方法学考察,建立了双黄连高效液相色谱指纹图谱,最适色谱条件为:流动相:A:水(含体积分数为1%的冰乙酸),B:乙腈;流速:1.0ml/min;检测波长:325 nm;流动相梯度洗脱程序:0-6 min,A:84%;6-12 min,A:84%-72%; 12.25 min,A:72%。 结果表明该色谱条件下各色谱峰的分离情况良好,对称性好,线性范围及定量限、检测限符合实验要求。 3.2影响探针回收率的因素以及内标物动态监测回收率的研究 灌流液流速越大,回收率越小并呈指数下降趋势;在一定温度范围内,透析媒介温度越高回收率越高;在一定浓度范围内,回收率保持稳定,透析液和透析媒介中的药物浓度呈线性关系;透析媒介中的物质数量越多,特定单一成分的回收率越低;探针的日内稳定性达7小时以上,能够满足体内研究的要求。 经筛选,最终选择葛根素作为本试验中的微透析内标物。体外模拟试验的测定结果表明,内标物释放率不随浓度变化,而在相同浓度下,流速越大回收率越低;透析媒介为双黄连林格氏液时,待测成分回收率与葛根素的释放率的比例P值不随透析媒介浓度变化,保持在一个稳定的水平。 3.3注射用双黄连(冻干)的体内药动学研究 使用微透析法测定体外兔血浆蛋白结合率,试验结果表明微透析法可用于双黄连体内药动学研究。使用血浆的3倍量甲醇作为蛋白沉淀剂处理传统血药浓度法获得的血液样品,效果较好。 药动学分析结果表明,使用微透析法与传统血药浓度法获得的结果趋势一致,表明双黄连在兔体内的药动学行为符合二房室模型,说明微透析法可用于中药复方药动学研究,但微透析法与传统血药浓度法各有利弊,在研究中需注意选择。 4结论 4.1使用梯度洗脱建立的注射用双黄连(冻干)高效液相色谱指纹图谱不仅能使制剂和血浆中的成分得到较好的分离,同时也能满足微透析内标物的洗脱要求。 4.2灌流液流速、温度以及透析媒介中所含物质的数量对探针回收率有影响,透析媒介浓度对探针回收率影响不大。 4.3确定葛根素作为动态监测待测成分微透析探针回收率的内标物,待测成分回收率与内标物释放率的比例P值可以保持稳定,不受探针周围药物浓度的影响。 4.4使用内标法测定双黄连的体外血浆蛋白结合率,确定可以使用微透析法进行双黄连兔体内药动学研究。 4.5同时使用微透析法和传统血药浓度法对兔体内的双黄连药动学行为进行研究,结果表明双黄连在兔体内的代谢符合二房室模型;使用微透析法可在同一只动物身上进行多次试验,而传统血药浓度法仅能进行一次;由微透析法获得的达峰时间具有一定的滞后性,峰值较血药浓度获得的数值小。……   
[关键词]:微透析;指纹图谱;中药复方;药动学
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:广州中医药大学2011年