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人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合多肽的制备及其生物学活性分析

朱元昌

  目的:将人溶菌酶N端序列hLYZ(N74)与Exendin-4的嵌合基因克隆到大肠杆菌,通过原核表达大量制备嵌合多肽hLYZ(N74)-Exendin-4,在体外分别研究其凝血酶水解产物hLYZ(N74)对AGEs的清除作用和Exendin-4对小鼠胰腺β瘤细胞增殖、相关基因的表达以及对胰岛素分泌的促进作用。 方法:通过定点突变将嵌合基因hLYZ(N74)-Exendin-4上凝血酶非特异酶切位点进行突变,然后转化大肠杆菌BL21并诱导表达和鉴定;优化表达体系,大量制备重组蛋白,在变性条件下利用亲和层析法纯化重组蛋白,再对纯化的重组蛋白进行复性,用肠激酶切割除去蛋白标签,在非变性条件下进行镍离子亲和层析,收集嵌合多肽hLYZ(N74)-Exendin-4,后者在体外经凝血酶切割,HPLC分离后,用质谱鉴定所获得的水解多肽片段,收集并浓缩子肽Exendin-4和hLYZ(N74)。通过MTT法测定Exendin-4对NIT-1细胞增殖的促进作用,实时定量PCR检测其对细胞PDX-1 mRNA水平的影响,化学发光法检测其对胰岛素分泌的刺激作用,从而分析Exendin-4在体外的生物学活性;人溶菌酶N端序列hLYZ(N74)的生物学活性通过Q-PCR测定其对AGEs的清除作用来确定。 结果:DNA测序结果表明,嵌合基因hLYZ(N74)一Exendin-4上凝血酶非特异酶切位点突变成功。在37℃条件下,IPTG浓度为0.8mmol、L诱导5h获得的重组蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白量27%;SDS-PAGE.Western blotting检测结果表明,重组蛋白条带与预期一致。亲和层析法获得的高纯度重组蛋白经肠激酶切割、镍离子柱层析获得较高纯度的嵌合多肽hLYZ(N74)-Exendin-4,经凝血酶水解和HPLC分离后,质谱检测到相对分子质量为4340.0和8697.1两种片段,其大小分别与Exendin-4和hLYZ(N74)完全吻合。体外实验结果表明,凝血酶水解产物hLYZ(N74)能够明显降低细胞的RAGE表达水平;Exendin-4能促进NIT-1细胞的增殖与活力,上调PDx-1基因表达水平和促进胰岛素分泌。两种多肽产物均表现出显著的生物学活性。 结论:获得了高纯度的嵌合多肽hLYZ(N74)-Exendin-4,可被凝血酶水解并释放出子肽Exendin-4和hLYZ(N74),且两种子肽均具有相应的生物学活性和药学效应。……   
[关键词]:Exendin-4;溶菌酶;糖尿病;晚期糖基化终产物;嵌合多肽
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:暨南大学2011年