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MFG-E8在小胶质细胞生理功能中的作用研究

聂盼

  小胶质细胞作为脑内常驻的免疫细胞,在中枢神经系统免疫防御病原体感染过程中扮演着至关重要的作用。当接触到内源性信号(如神经元功能紊乱/死亡、异常蛋白的聚集或免疫细胞的相互作用)或是外源性刺激信号(如感染)时,小胶质细胞可迅速由静息状态激活,从而发挥组织修复、神经营养支持、引发炎症或激活淋巴细胞等作用。活化的小胶质细胞释放一些抗炎成分(如IL-10、TGF-β)和神经营养物质(如神经营养因子,NGF)来保护和维持受损神经元,同时也释放促炎症因子(如前列腺素、TNF-α、IL-1β等细胞因子)、分泌蛋白酶以及生成活性氧(reactive oxygen species, ROS)。炎症反应有利于机体清除入侵的病原微生物,清除损伤坏死的细胞及异常聚集沉积的蛋白质,促进损伤组织的修复。但是过度活化的小胶质细胞会产生严重的神经毒性作用,过强的炎症反应会进一步加重组织损伤,长期的炎症刺激则可发展成慢性炎症性疾病。有研究指出,以小胶质细胞活化为特征的炎症是许多神经变性疾病发生过程中的关键环节。故在治疗和减缓神经系统疾病过程中,应避免小胶质细胞过度活化导致的神经元损伤。同时,小胶质细胞在中枢神经系统炎症反应中起关键作用,也是抗炎药物重要的靶点。 小胶质细胞/巨噬细胞识别、吞噬凋亡细胞主要由复杂的蛋白受体介导,其分子机制是目前神经免疫学研究的热点。研究发现,乳脂小球表皮生长因子VIII (Milk Fat Globule Epidermal Growth Factor 8, MFG-E8)是介导巨噬细胞吞噬凋亡细胞的关键因子。巨噬细胞分泌蛋白MFG-E8连接到凋亡细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS),然后锚定到巨噬细胞表面的整合素αvβ5,启动巨噬细胞内CrkII-DOCK180-Racl信号通路,导致细胞内蛋白骨架重排,进而发挥吞噬作用。而外源性加入MFG-E8的同分异构体D89E蛋白,可以有效封闭该通路,抑制细胞的吞噬活性,加重炎症反应。2004年,Hanayama等在基因敲除MFG-E8的老鼠模型中发现,巨噬细胞虽然可以通过其他途径结合凋亡细胞,但不能吞噬凋亡细胞而导致大量凋亡细胞的沉积,最终引起脾脏肿大和严重的自身免疫性疾病。该研究肯定了MFG-E8-αvβ5-Rac1信号通路的独特性和重要性。在小胶质细胞中发现,外源性添加MFG-E8能够促进小胶质细胞对凋亡细胞的吞噬。而加入MFG-E8的同分异构体D89E抑制小胶质细胞对凋亡细胞的吞噬。在此基础上,我们推测MFG-E8在调控中枢神经系统小胶质细胞的吞噬行为中发挥重要作用。然而,其调节小胶质细胞的吞噬是否通过PS-MFG-E8-avp5-Rac1信号通路来完成,以及小胶质细胞活化后吞噬功能与炎症反应之间是何种关系,目前尚无研究。 本研究通过分别阻断与过表达MFG-E8在小胶质细胞中的表达,从小胶质细胞吞噬过程入手,制备红细胞PS外翻凋亡模型,观察小胶质细胞对PS外翻凋亡红细胞的吞噬作用。分析内源性MFG-E8的改变对小胶质细胞的吞噬能力的影响。在此基础上,分析小胶质细胞吞噬功能与炎症反应之间的关系。研究分为三部分: 一,将磷脂酰丝氨酸以脂质体的形式整合到正常红细胞表面,构建PS外翻的红细胞凋亡模型。利用共培养技术,检测小胶质细胞对凋亡红细胞的吞噬情况,同时检测小胶质细胞发挥吞噬作用时炎症因子表达量的变化。 通过脂质体整合,得到红细胞PS外翻率为7.4%~47.5%。其中,经NEM (20μM, 10min)处理后,再与PSox脂质体整合的红细胞PS外翻率为35.7%,相对于经NEM(30μM,30min)处理后再整合PSox的红细胞PS外翻率47.5%更为稳定。故我们采用PS外翻率为35.7%的红细胞进行下一步的吞噬实验。在吞噬检测中,相对于正常对照组,小胶质细胞对凋亡红细胞的吞噬率具有显著统计学意义(27.5%±5.4% vs 3.8%±1.0%,p<0.01)。同时,Real-time PCR检测吞噬红细胞后小胶质细胞中炎症因子IL-1β和TNF-α发现。相对于正常组,实验组小胶质细胞中炎症因子的表达随着其吞噬功能的增加而下降。 二,分别构建MFG-E8过表达载体和RNA干扰慢病毒表达载体,检测其过表达和阻断MFG-E8表达的效率。MFG-E8过表达载体稳定转染小胶质细胞后,通过检测GFP融合蛋白判断小胶质细胞中MFG-E8表达增加。同时,用RNA干扰载体稳定转染后,Real-time PCR和Western Blotting检测小胶质细胞中MFG-E8的表达,结果显示可有效阻断MFG-E8的表达。 三,用过表达载体和RNA干扰载体转染小胶质细胞,检测小胶质细胞中MFG-E8的表达变化。内源性调节小胶质细胞中MFG-E8的表达后,检测小胶质细胞对凋亡红细胞的吞噬率,同时检测吞噬后小胶质细胞中炎症因子的表达。 MFG-E8过表达和RNA干扰转染后,相对于对照组,过表达MFG-E8的小胶质细胞对凋亡红细胞的吞噬率有明显提高(32.9%±9.6% vs 21.5%±6.28%,p<0.01);而相对于对照组,阻断MFG-E8的小胶质细胞对凋亡红细胞的吞噬受到明显抑制(17.5%±4.1% vs 22.2%±7.8%,p<0.01)。同时,MFG-E8表达上升引起小胶质细胞吞噬能力增加的同时,小胶质细胞表达的炎症因子也明显增加;相反,阻断MFG-E8的表达引起小胶质细胞的吞噬能力下降的同时,小胶质细胞表达的炎症因子也减少。 研究表明,内源性改变小胶质细胞中MFG-E8的表达变化,能够影响其吞噬功能。促进MFG-E8的表达可促进小胶质细胞对PS外翻的凋亡红细胞的吞噬能力。同时炎症因子表达上升;相反,阻断MFG-E8的表达可抑制小胶质细胞的吞噬能力,而炎症因子表达下降。说明MFG-E8在小胶质细胞吞噬行为中有着重要调控作用。并可能为小胶质细胞吞噬机制中的一个重要信号分子。……   
[关键词]:小胶质细胞;MFG-E8;吞噬功能;炎症反应;磷脂酰丝氨酸
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2011年