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重组蛋白A的分离纯化工艺研究

侯率

  金黄色葡萄球菌蛋白A具有与免疫球蛋白特异性结合的能力,在抗体的检测和纯化、免疫细胞化学、病原体的快速诊断以及免疫吸附治疗等领域有着广泛的应用。利用基因工程技术生产重组蛋白A (rPA)是大量获得蛋白A产品的主要方法,目前国外已经成功实现了其工业化生产,而国内在这方面仍大量依赖进口。为了实现rPA的国产化,本论文在实验室前期原核表达与发酵研究工作的基础上,尝试建立一种适合于大规模制备能够满足医用要求的rPA分离纯化工艺。本论文的研究内容包括以下几个部分: (1)研究rPA的提取与初分离纯化技术。确定采用80℃加热处理10 min去除大部分热不稳定的杂蛋白,75%(v/v)乙醇沉淀实现蛋白溶液的快速脱盐更换。 (2)研究rPA的层析精分离纯化技术。首先优化了DEAE弱阴离子交换层析介质的合成条件。对于DEAE弱阴离子交换层析,主要考察了起始缓冲液pH对层析分离的影响,发现起始缓冲液pH对rPA纯化效果影响较小。优化后的层析条件为:采用线性离子强度梯度洗脱的方式,洗脱梯度:10倍柱体积,0-18%B线性洗脱;流动相A为25 mM Tris-HCl, pH 8.0,流动相B为25 mM Tris-HCl, lMNaCl, pH 8.0。对于MEP疏水电荷诱导层析,考察了配基密度、平衡缓冲液pH和盐浓度、洗脱缓冲液pH等对rPA纯化的影响,发现高的配基密度有利于增大结合容量,而对选择性影响较小,平衡缓冲液pH和盐浓度对rPA的结合影响较小,rPA的结合具有非盐依赖性。优化后的层析条件为:平衡缓冲液为25 mM Tris-HCl, pH 8.0,洗脱缓冲液为100 mM柠檬酸缓冲液,pH 3.5。 (3)在上述研究基础上,通过合理选择与组合,确定了rPA分离纯化工艺路线:细胞破碎后依次采用热沉淀、乙醇沉淀、离子交换层析及疏水电荷诱导层析。进行了实验室规模rPA的分离纯化,终产品经SDS-PAGE、SEC-HPLC及RP-HPLC分析,纯度达到98%以上,总回收率为61%。并对终产品进行了鉴定分析,MALDI-TOF-MS测得分子量为32743.585 Da,等电聚焦电泳法测得等电点为4.46, Western blot显示具有良好的反应原性,N端序列分析证实纯化的rPA具有完整的N端序列,且具有与进口rPA相当的人IgG结合能力。最后对rPA保存方法的初步研究表明,纯化后的rPA保存在25 mM PBS, 100mM NaCl, pH 7.4溶液中,于-80℃冻存具有较好的稳定性。 通过本论文的研究,建立了rPA的分离纯化工艺,研究结果为大规模制备rPA奠定了基础。……   
[关键词]:重组蛋白A;分离纯化;疏水电荷诱导层析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:大连理工大学2011年