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双水相萃取偶联柱层析分离纯化重组白蛋白

张帆

  人血清白蛋白为人体血浆中含量最丰富的蛋白,具有很多重要的生理功能。临床上可作为很多疾病的药品治疗剂,还可作为生物产品的保护剂和赋形剂及细胞培养的添加成分,得到了广泛应用。近年来大规模生产重组人血清白蛋白作为血源白蛋白替代品。针对从高密度发酵液中分离纯化重组人血清白蛋白中存在的固液分离困难、工艺复杂、杂质难去除等问题,本论文从以下方面做了探索性研究。 首先,考察了不同乙醇/无机盐双水相体系对重组人血清白蛋白的萃取能力,其中乙醇/磷酸氢二钾双水相体系的回收率最高,且在4-30℃的温度和1-30g/L的重组人血清白蛋白浓度均能保持较高萃取收率。该双水相体系能够直接从发酵液中萃取重组人血清白蛋白,当操作条件为乙醇20%(w/w)/磷酸氢二钾18%(w/w)时,重组人血清白蛋白回收率达到108.13%。综合考虑回收率和相比因素,选择乙醇18%(w/w)/磷酸氢二钾20%(w/w)体系放大实验,0.01-73L规模的平均回收率为100.4%,菌体的平均去除率达到99%。同时该双水相体系能够有效去除发酵液中的部分杂蛋白,还可以去除87.2%的多糖,并使上相的蛋白酶A活性降低了24.4%,部分抑制了蛋白酶B的活性,提高了重组人血清白蛋白的稳定性。双水相萃取将固液分离、萃取、浓缩、初级纯化整合为一步进行。通过研究成相物质的回收,上相中的乙醇和下相中的磷酸氢二钾回收率均在80%以上。 其次,根据双水相上相的特点,建立了与之相适应的纯化方法:包括减压蒸馏去除乙醇、Phenyl SepharoseTM疏水层析纯化、DEAE阴离子交换层析去除多聚体等步骤。其中向平衡液中添加含1.2mol/L的磷酸氢二钾,为疏水层析的最优条件,此时收率为74.94%,还原SDS-PAGE电泳结果表明纯化的重组人血清白蛋白达到了电泳纯。而且纯化的重组人血清白蛋白能够长期保存,其中蛋白酶A活性降至上清液的9.18%,蛋白酶B可能被去除。 最后,对上述方法分离纯化得到的重组人血清白蛋白纯度、杂质含量、二级结构及分子量进行了分析。高效液相色谱检测其纯度达到了99.77%,色素比值A350/A280为0.028。同时,其多糖含量为2.98μg/mg,蛋白酶A活性降为上清液的2.93%。而且,纯化的重组人血清白蛋白分子量及二级结构与血源白蛋白具有一致性。 双水相萃取耦合柱层析技术提供了一种简便的、分离纯化得到高纯度重组人血清白蛋白的方法,具有分离时间短、收率高、杂质去除效果好的优点,具有产业化的前景。……   
[关键词]:重组人血清白蛋白;双水相萃取;分离;纯化;疏水层析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:大连理工大学2011年