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柔嫩艾美耳球虫Rhomboid蛋白与微线蛋白相互作用的研究

郑君

  随着现代化养鸡业的发展,鸡球虫病已成为四季多发性疾病,预防和治疗球虫病目前已成为研究的焦点。由于长期以来传统药物的使用,使得球虫产生一定的耐药性,再加上药物残留等问题使得球虫病的防治愈发困难。免疫预防是控制该病的主要手段,但是因为球虫生活史复杂,侵入机制尚不清楚,目前行之有效的疫苗较少,对于疫苗候选基因的选择亟待解决。微线蛋白作为一种粘附相关蛋白,由位于虫体顶端的微线体分泌,是虫体识别和结合宿主细胞受体的关键性蛋白。Rhomboid蛋白自发现以来一直吸引着研究者的注意。作为一类膜内的丝氨酸蛋白酶,它参与着表皮生长因子及表皮生长因子受体信号的转导。近年来人们在很多顶器门的原虫体内也发现了Rhomboid蛋白的存在,其中包括柔嫩艾美耳球虫。经过对弓形虫和疟原虫Rhomboid蛋白的鉴定,发现Rhomboid蛋白水解其底物MIC蛋白是虫体侵入宿主细胞的关键过程,而柔嫩艾美耳球虫Rhomboid蛋白的功能还未见报道,它能否水解MIC蛋白,其水解过程是不是球虫侵入的关键过程还有待研究。 酵母作为一种提高免疫力的佐剂,早已经被人们研究和关注。酵母细胞中含有大量的葡聚糖和甘露寡糖,可以提高免疫能力,增加抗体效价和外周血中淋巴细胞的数量,从而增加机体的抗菌抗癌能力。然而酵母作为免疫佐剂的应用方向还有待进一步拓宽,在防治寄生虫病方面将具有意义深远的研究价值。3,4二氯异香豆素(DCI)是一种非常有效的丝氨酸蛋白酶抑制剂,它能够使大多数丝氨酸蛋白酶失去活性,据报道,DCI可以抑制果蝇属Rhomboid-1的酶活性,影响其EGFR的信号转导;也能够抑制弓形虫TgROM5的活性,影响速殖体侵入宿主细胞。而DCI是否能够抑制柔嫩艾美耳球虫Rhomboid的活性,从而影响其侵入,目前还未见报道。 本研究首先根据CytoTrap酵母双杂交系统,验证了E. tenella Rhomboid蛋白对温度敏感型酵母菌株cdc25H存在自激活作用;然后根据Ga14酵母双杂交系统,成功构建诱饵表达质粒pGBKT7-Rho与捕获质粒pGADT7-MIC1和pGADT7-MIC4,通过诱饵质粒与捕获质粒共转化酵母细胞AH109,从而筛选出与Rhomboid蛋白相互作用的MIC4蛋白;免疫共沉淀进一步验证Rhomboid与MIC4蛋白存在相互作用:将含有互作蛋白的酵母细胞AH109破碎后免疫雏鸡,攻虫试验证明互作蛋白对雏鸡具有一定的免疫保护作用,抗球虫指数可以达到168.24;最后验证了DCI体外对子孢子侵入细胞的抑制作用。为柔嫩艾美耳球虫侵入细胞的分子机制研究奠定了基础,也为球虫病的防治提供了理论依据。 E.tenella Rhomboid蛋白CytoTrap酵母双杂交系统自激活作用的鉴定通过RT-PCR扩增Rhomboid基因并对其分析,然后根据CytoTrap酵母双杂交系统构建诱饵质粒pSos-Rho,将诱饵质粒与对照质粒共转化酵母细胞中,从而验证Rhomboid蛋白的自激活作用。结果表明,成功扩增了柔嫩艾美耳球虫Rhomboid基因开放阅读框并构建了重组诱饵表达载体pSos-Rho,同源性比对分析得出Rhomboid蛋白即柔嫩艾美耳球虫EtROM3.Western blot显示诱饵蛋白在酵母细胞中可以成功表达,间接免疫荧光将重组蛋白定位于宿主酵母cdc25H细胞膜附近。通过将诱饵质粒与对照质粒共转化酵母细胞中,结果显示重组诱饵融合蛋白激活了宿主菌cdc25H的Ras途径,导致酵母细胞在37℃半乳糖培养基上能够生长,说明诱饵质粒对于CytoTrap酵母双杂交系统存在自激活作用,从而不能使用本系统进行互作蛋白的筛选。 E.tenella Rhomboid蛋白相互作用的MIC蛋白的筛选首先通过RT-PCR扩增柔嫩艾美耳球虫MIC1和MIC4基因片段,然后根据Ga14酵母双杂交系统构建诱饵质粒pGBKT7-ROM,捕获质粒pGADT7-MIC1和pGADT7-MIC4,将捕获质粒分别与诱饵质粒共转化酵母细胞AH109中,验证蛋白的交互作用。结果表明,重组诱饵质粒与捕获质粒均构建成功,目的基因可以在感受态酵母细胞中表达,诱饵蛋白对酵母细胞既没有毒性,也不存在自激活作用。通过Ga14酵母双杂交系统验证,Rhomboid蛋白与MIC4蛋白存在相互作用,Western blot鉴定结果显示MIC4蛋白长度变小,推测是由于Rhomboid蛋白酶的切割作用所致。 Rhomboid与MIC4蛋白相互作用的鉴定构建重组原核表达质粒pET28a-MIC4,重组真核表达质粒pcDNA-Myc-ROM和pcDNA-HA-MIC4,对柔嫩艾美耳球虫MIC4蛋白进行原核表达,纯化及复性,从而通过免疫共沉淀鉴定Rhomboid与MIC4蛋白间的互作;然后将构建的重组真核表达质粒共转染HeLa细胞,免疫共沉淀鉴定Rhomboid蛋白与MIC4蛋白间的相互作用。结果表明,重组原核与真核表达质粒均构建成功;将原核表达的Rhomboid与MIC4蛋白混合,通过免疫共沉淀说明,两种蛋白存在相互作用;将真核重组质粒共转染HeLa细胞,间接免疫荧光显示Rhomboid蛋白与MIC4可以成功表达;将共转染重组质粒的HeLa细胞破碎后,通过免疫共沉淀以及Western blot鉴定,Rhomboid蛋白与MIC4蛋白存在相互作用,而且Rhomboid蛋白具有酶切活性,可以切割其底物MIC4蛋白。这个试验的结果为更深入的研究球虫侵入宿主细胞的分子机制提供了理论依据。 酵母中互作蛋白的动物保护性研究将含有Rhomboid蛋白、MIC4蛋白以及互作蛋白的酵母细胞AH109破碎后免疫雏鸡,从而进行攻虫试验,观察酵母细胞中具有互相作用的两种蛋白对柔嫩艾美耳球虫的动物保护性。结果说明,通过体液免疫水平和细胞免疫水平的检测,各实验组与对照组相比差异均显著(P<0.05),其中含有两种互作蛋白的实验组差异极显著(P<0.01);攻虫试验结果显示其ACI可以达到168.24;同时试验结果首次表明酵母细胞也能够产生一定的免疫保护作用。本试验为鸡球虫病疫苗的研究提供了理论依据,也为酵母在寄生虫病方面的应用研究奠定了基础。 DCI对子孢子侵染细胞的体外抑制试验进行柔嫩艾美耳球虫的体外原代鸡肾细胞培养,将DCI分成两组,一组提前作用于子孢子,一组与子孢子共同培养,然后通过对第一代裂殖体、第二代裂殖体以及子代卵囊的数量统计,观察不同浓度DCI体外对球虫子孢子侵染细胞的抑制作用。结果说明,20μM的DCI即可有效抑制子孢子体外对鸡肾细胞的侵入,同时能够控制球虫子代卵囊的产出量,对球虫病有潜在的治疗作用,有望成为抗球虫药物的候选成分,为球虫病的治疗研究奠定基础。本试验结果表明DCI通过抑制Rhomboid蛋白酶活性可以间接抑制球虫子孢子对宿主细胞的侵染,更进一步说明Rhomboid的酶切作用在虫体侵入过程中的重要地位,同时研究结果也为球虫病的治疗提供了理论依据。……   
[关键词]:柔嫩艾美耳球虫;Rhomboid;MIC;酵母双杂交;相互作用
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林大学2011年