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MDBK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及其鉴定

张巍

  水泡性口炎(Vesicular stomatitis, VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)引起的人畜共患的病毒性传染病,临床上以在感染动物的舌、唇、颊、乳头和蹄冠等部位出现水泡和溃疡为特征;人偶发感染,出现类似流感样症状。该病在北美和中美首次爆发后,逐渐传播到南美、非洲、欧洲以及亚洲的一些国家和地区,我国也有该病的报道。为了给该病的防治提供确实可靠的理论依据,对VSV分子致病机制的研究,特别是细胞膜受体的研究已经成为VSV研究的焦点。 酵母双杂交系统作为一种在体内研究蛋白质-蛋白质间相互作用的简单有效的方法,已经被广泛地应用于病毒的研究中。本研究所采用的CytoTrap XR酵母双杂交系统(SOS恢复系统)是建立于传统酵母双杂交系统的基础之上。与传统的酵母双杂交系统相比,该系统优点在于所检测的蛋白质间的相互作用是发生在细胞质中而不是细胞核上;更适用于研究转录因子及那些在细胞质中需要翻译后修饰的蛋白质。CytoTrap XR酵母双杂交系统为体内检测蛋白质间的相互作用提供了一个更加准确、简便、高效的方法。 由于VSV具有广泛的细胞嗜性,本研究将VSV接种于MDBK细胞,通过倒置显微镜观察细胞能够出现明显的CPE,并对收集的病毒液进行电镜负染观察,可见典型的子弹状病毒粒子,证实了VSV可以感染MDBK细胞并在其上繁殖扩增。间接免疫荧光检测结果显示,在感染VSV的MDBK细胞胞浆内可以看到绿色荧光出现,这表明VSV主要在胞浆中增殖。 根据VSV能够感染MDBK细胞,并出现典型的细胞病变的特点,可以推测在MDBK细胞膜上存在有VSV的特异性受体。本研究提取MDBK细胞总RNA,分离纯化mRNA,并将其反转录成带有酶切位点的cDNA,利用CytoTrap XR建库试剂盒构建MDBK细胞的酵母双杂交cDNA文库,经鉴定原始文库的库容量约为3.5×105,扩增后的文库库容量约为6×108,文库的重组率为95%,文库插入片段均大于500bp,平均插入片段长度约为800bp。这说明成功构建了MDBK细胞酵母双杂交cDNA文库,为筛选VSV的细胞膜受体进而研究其分子致病机制奠定了坚实的基础。……   
[关键词]:水泡性口炎病毒;MDBK细胞;酵母双杂交;cDNA文库
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林大学2011年